檸檬酸(citric acid, CA)含量測(cè)定試劑盒說明書
微量法100管/96樣
注 意 :正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。
測(cè)定意義:
CA是生物體內(nèi)常見的有機(jī)酸,是重要的食品風(fēng)味物質(zhì)。此外,CA是三羧酸循環(huán)第一步反應(yīng)的產(chǎn)物。
測(cè)定原理:
酸性條件下,檸檬酸還原Cr6+生成Cr3+,在545nm處有特征吸收峰;通過測(cè)定545nm吸光值的增加,即可計(jì)算出樣品中檸檬酸含量。
自備儀器和用品:
低溫離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液槍、可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板和蒸餾水。
試劑組成和配置:
試劑一:液體×1瓶,4℃保存。
試劑二:液體×1瓶,4℃保存。
試劑三:液體×1管,-20℃保存。
試劑四:粉劑×1管,室溫保存。臨用前配制,加入2mL試劑一,充分溶解。
試劑五:液體×1管,4℃避光保存。
標(biāo)準(zhǔn)品:液體×1管,250μmol/L檸檬酸標(biāo)準(zhǔn)液,4℃保存。
樣品中檸檬酸提?。?/p>
1. 液體樣品中檸檬酸提?。喝?.1mL液體加試劑一0.9mL,充分混勻,11000g, 4℃離心10min,取上清液,待測(cè)。
2. 組織中檸檬酸提?。喊凑战M織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL試劑一)進(jìn)行冰浴勻漿。11000g,4℃離心10min,取上清置冰上待測(cè)。
3. 線粒體中檸檬酸提?。喊凑战M織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL試劑一)進(jìn)行冰浴勻漿,600g/min,4℃離心5min;取上清至另一EP管中,11000g,4℃離心10min,棄上清(此上清液可用于細(xì)胞質(zhì)CA含量測(cè)定);向沉淀中加試劑二200μl,以及試劑三2μl,充分懸浮溶解,11000g,4℃離心10min,取上清液,待測(cè)。
4. 細(xì)菌、真菌中:按照細(xì)胞數(shù)量(104個(gè)):試劑一體積(mL)為500~1000:1的比例(建議500萬細(xì)胞加入1mL試劑一),冰浴超聲波破碎細(xì)胞(功率300w,超聲3秒,間隔7秒,總時(shí)間3min);11000g,4℃離心10min,取上清置冰上待測(cè)。
測(cè)定操作:
1. 分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30 min,調(diào)節(jié)波長到545 nm,蒸餾水調(diào)零。
2. 試劑一置于30℃水浴中預(yù)熱30min。
3. 空白管:取0.5 mL EP管,依次加入20μL蒸餾水,140μL試劑一,20μL試劑四,20μL試劑五,混勻后室溫靜置30min,于545nm測(cè)定吸光度,記為A空白管。
4. 標(biāo)準(zhǔn)管:取0.5 mL EP管,依次加入20μL標(biāo)準(zhǔn)液,140μL試劑一,20μL試劑四,20μL試劑五,混勻后室溫靜置30min,于545nm測(cè)定吸光度,記為A標(biāo)準(zhǔn)管。
5. 測(cè)定管:取0.5 mL EP管,依次加入20μL上清液,140μL試劑一,20μL試劑四,20μL試劑五,充分混勻后室溫靜置30min,于545nm測(cè)定吸光度,記為A測(cè)定管。
注意:空白管和標(biāo)準(zhǔn)管只需測(cè)定一次。
計(jì)算公式:
a.使用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下
1. 按液體樣品的體積計(jì)算
檸檬酸含量(nmol/L)= [C標(biāo)準(zhǔn)液×(A測(cè)定管-A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)]×樣品稀釋倍數(shù)×V總
= 2500×(A測(cè)定管-A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)
C標(biāo)準(zhǔn)液:250μmol/L=0.25 m mol/L;樣品稀釋倍數(shù):(0.1 mL樣品+0.9mL試劑一)÷ 0.1 mL樣品=10;V總:1mL。
2. 按組織質(zhì)量計(jì)算
檸檬酸含量(nmol/g 鮮重)= [C標(biāo)準(zhǔn)液×(A測(cè)定管-A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)]×V總÷W
= 250×(A測(cè)定管-A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管) ÷W
C標(biāo)準(zhǔn)液:250 μ mol/L;V總:上清液總體積,1.0 mL=0.001 L;W:樣品質(zhì)量,g。
3. 按蛋白含量計(jì)算
檸檬酸含量(nmol/mg prot)= [C標(biāo)準(zhǔn)液×(A測(cè)定管-A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)]÷Cpr
= 250×(A測(cè)定管-A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管) ÷Cpr
C標(biāo)準(zhǔn)液:250 μ mol/L=0.25μ mol/mL;Cpr:上清液蛋白質(zhì)含量,mg/mL。
4. 按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算
檸檬酸含量(nmol/104 cell)= [C標(biāo)準(zhǔn)液×(A測(cè)定管-A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)]×V總÷細(xì)胞數(shù)量
= 250×(A測(cè)定管-A空白管) ÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管) ÷細(xì)胞數(shù)量
C標(biāo)準(zhǔn)液:250 μ mol/L;V總:上清液總體積,1.0 mL=0.001 L;
b.使用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下
3. 按液體樣品的體積計(jì)算
檸檬酸含量(nmol/L)= [C標(biāo)準(zhǔn)液×(A測(cè)定管-A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)]×樣品稀釋倍數(shù)×V總
= 2500×(A測(cè)定管-A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)
C標(biāo)準(zhǔn)液:250μmol/L=0.25 m mol/L;樣品稀釋倍數(shù):(0.1 mL樣品+0.9mL試劑一)÷ 0.1 mL樣品=10;V總:1mL。
4. 按組織質(zhì)量計(jì)算
檸檬酸含量(nmol/g 鮮重)= [C標(biāo)準(zhǔn)液×(A測(cè)定管-A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)]×V總÷W
= 250×(A測(cè)定管-A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管) ÷W
C標(biāo)準(zhǔn)液:250 μ mol/L;V總:上清液總體積,1.0 mL=0.001 L;W:樣品質(zhì)量,g。
5. 按蛋白含量計(jì)算
檸檬酸含量(nmol/mg prot)= [C標(biāo)準(zhǔn)液×(A測(cè)定管-A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)]÷Cpr
= 250×(A測(cè)定管-A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管) ÷Cpr
C標(biāo)準(zhǔn)液:250 μ mol/L=0.25μ mol/mL;Cpr:上清液蛋白質(zhì)含量,mg/mL。
6. 按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算
檸檬酸含量(nmol/104 cell)= [C標(biāo)準(zhǔn)液×(A測(cè)定管-A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)]×V總÷細(xì)胞數(shù)量
= 250×(A測(cè)定管-A空白管) ÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管) ÷細(xì)胞數(shù)量
C標(biāo)準(zhǔn)液:250 μ mol/L;V總:上清液總體積,1.0 mL=0.001 L;
注意事項(xiàng):
1. 樣品處理等過程均需要在冰上進(jìn)行。
2. 試劑四需現(xiàn)配現(xiàn)用,配置好的一周內(nèi)使用完;
3. 試劑五為易致癌物質(zhì),實(shí)驗(yàn)過程中,需佩戴手套,避免試劑五濺到皮膚上。
4. 檸檬酸提取液不能用于蛋白含量測(cè)定,如需測(cè)定蛋白含量,需另取組織,使用本公司BCA試劑盒進(jìn)行測(cè)定。
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