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漆酶(Laccase)試劑盒說明書

發(fā)布時間:2023/10/20      點擊次數(shù):258

漆酶(Laccase)試劑盒說明書

                                                微量法 100T/48S

 

   :正式測定之前選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。

測定意義:

漆酶(CE1.10.3.2)是一種含銅的多酚氧化酶,屬于銅藍氧化酶家族,廣泛分布于真菌和高等植物中,具有較強的氧化還原能力,在紙漿生物漂白,環(huán)境污染物降解和木質(zhì)纖維素降解以及生物檢測方面有非常廣泛的應(yīng)用。

 

測定原理:

漆酶分解底物ABTS產(chǎn)生ABTS自由基,在420nm處的吸光系數(shù)遠大于底物ABTS,測定ABTS自由基的增加速率,可計算得漆酶活性。

 

自備實驗用品及儀器:

天平、低溫離心機、可見分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96孔板、恒溫水浴鍋。

 

試劑組成和配制:

提取液:液體100mL×1瓶,4℃保存。

試劑一:液體30mL×1瓶,4℃保存。

工作液:粉劑×1瓶,4℃避光保存,臨用前加15mL試劑一溶解;用不完的試劑4℃保存一周。

 

酶液提?。?/span>

1.   組織:按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)15~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL提取液),進行冰浴勻漿。12000g 4℃離心30min,取上清,置冰上待測。

2.   細胞:按照細胞數(shù)量(104個):提取液體積(mL)為500~10001的比例(建議500萬細胞加入1mL提取液),冰浴超聲波破碎細胞(功率300w,超聲3秒,間隔7秒,總時間3min);然后4℃,10000g離心10min,取上清置于冰上待測。

3.   細胞培養(yǎng)液:直接檢測。

 

測定操作表:

 


對照管

測定管

樣本(μL

45

45

試劑一(μL

255


工作液(μL


255

60℃水浴20min后冷卻至室溫,取200μL反應(yīng)液于微量石英比色皿/96孔板中測定420nm處吸光值A,△A=A測定管-A對照管


注意:

1、   極少數(shù)樣本在60℃水浴20min后會出現(xiàn)沉淀,可經(jīng)過8000g 25℃離心10min后,取上清檢測,例如成

 

      熟的水稻葉片樣本。

2、   為確保檢測準確性,若ΔA大于1,將樣本用提取液稀釋2~10倍后重新檢測,計算公式乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)。

 

 

酶活性計算公式:

a.用微量石英比色皿測定的計算公式如下

1.按照蛋白濃度計算

酶活性定義:每毫克蛋白每分鐘氧化1nmol底物ABTS所需的酶量為一個酶活力單位。

漆酶活性(nmol/min /mg prot= ×V反總÷V×Cpr÷T= 9.26×△A÷Cpr

2.按照樣本質(zhì)量計算

酶活性定義:每克樣品每分鐘氧化1nmol底物ABTS所需的酶量為一個酶活力單位。

漆酶活性(nmol/min /g 鮮重)= ×V反總÷V×W÷V樣總)÷T= 9.26×△A÷W

3.按照細胞數(shù)量計算

酶活性定義:104個細胞每分鐘氧化1nmol底物ABTS所需的酶量為一個酶活力單位。

漆酶活性(nmol/min /104 cell= ×V反總÷V×細胞數(shù)量÷V樣總)÷T= 9.26×△A÷細胞數(shù)量

4.按照液體體積計算

酶活性定義:每升培養(yǎng)液每分鐘氧化1nmol底物ABTS所需的酶量為一個酶活力單位。

漆酶活性(nmol/min /L= ×V反總÷V÷T= 9260×△A

εABTS毫摩爾消光系數(shù):36L/mmol/cmd:比色皿光徑,1cmV反總:反應(yīng)總體積,0.3mLV樣:反應(yīng)體系中樣本體積,0.03mLV樣總:加入提取液體積,1mLCpr:樣本蛋白濃度,mg/mLW,樣本質(zhì)量,g;T:反應(yīng)時間,20min

 

b. 96孔板測定的計算公式如下

1.按照蛋白濃度計算

酶活性定義:每毫克蛋白每分鐘氧化1nmol底物ABTS所需的酶量為一個酶活力單位。

漆酶活性(nmol/min /mg prot= ×V反總÷V×Cpr÷T= 18.52×△A÷Cpr

2.按照樣本質(zhì)量計算

酶活性定義:每克樣品每分鐘氧化1nmol底物ABTS所需的酶量為一個酶活力單位。

漆酶活性(nmol/min /g 鮮重)= ×V反總÷V×W÷V樣總)÷T= 18.52×△A÷W

3.按照細胞數(shù)量計算

酶活性定義:104個細胞每分鐘氧化1nmol底物ABTS所需的酶量為一個酶活力單位。

漆酶活性(nmol/min /104 cell= ×V反總÷V×細胞數(shù)量÷V樣總)÷T

= 18.52×△A÷細胞數(shù)量

4.按照液體體積計算

 

酶活性定義:每升培養(yǎng)液每分鐘氧化1nmol底物ABTS所需的酶量為一個酶活力單位。

漆酶活性(nmol/min /L= ×V反總÷V÷T= 18520×△A

εABTS毫摩爾消光系數(shù):36L/mmol/cm;d:比色皿光徑,0.5cm;V反總:反應(yīng)總體積,0.3mL;V樣:反應(yīng)中樣本體積,0.045mL;V樣總:加入提取液體積,1mL;Cpr:樣本蛋白濃度,mg/mL;W,樣本質(zhì)量,g;T:反應(yīng)時間,20min


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