硫氧還蛋白過氧化物酶(TPX)活性測定試劑盒說明書
微量法100T/96S
注 意:正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定。
測定意義:
TPX屬于過氧化物酶家族,在體內(nèi)主要通過還原過氧化氫和一些氫過氧化物來實現(xiàn)抗氧化作用,功能與GPX類似,也是谷胱甘肽氧化還原循環(huán)關鍵酶之一。TPX普遍存在于各種生物體內(nèi),如酵母、植物、動物、原生動物、寄生蟲、細菌和古細菌,在進化上高度保守。TPX與細胞增殖、分化、細胞凋亡及腫瘤發(fā)生調(diào)控密切相關。TPX的主要功能包括細胞脫毒、抗氧化和調(diào)節(jié)由過氧化氫介導的信號轉(zhuǎn)導和免疫反應。
測定原理:
TPX催化H2O2氧化二硫蘇糖醇(DTT),H2O2的吸收波長為240nm,通過測定240nm吸光度的下降速率,即可計算出TPX活性。
自備儀器和用品:
低溫離心機、水浴鍋、可調(diào)節(jié)移液器、紫外分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96孔板(UV板)、和蒸餾水
試劑組成和配制:
試劑一:液體120mL×1瓶,室溫保存。
試劑二:液體20mL×1瓶,- 20℃保存。
試劑三:液體2mL×1支,4℃。
粗酶液提?。?/span>
1. 組織:按照組織質(zhì)量(g):試劑一體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL試劑一)進行冰浴勻漿。8000g,4℃離心10min,取上清置冰上待測。
2. 細菌、真菌:按照細胞數(shù)量(104個):試劑一體積(mL)為500~1000:1的比例(建議500萬細胞加入1mL試劑一),冰浴超聲波破碎細胞(功率300w,超聲3秒,間隔7秒,總時間3min);然后8000g,4℃,離心10min,取上清置于冰上待測。
3. 血清等液體:直接測定。
TPX測定操作:
取微量石英比色皿或96孔板,加入4 μL上清液,180 μL試劑二,16 μL試劑三,迅速混勻后于240 nm測定10s和130s吸光度,記為A1和A2。
TPX活性計算公式:
a.使用微量石英比色皿測定的計算公式如下
(1). 按蛋白濃度計算
活性單位定義:25℃或者37℃中,每毫克蛋白每分鐘催化1nmol H2O2降解為1個酶活單位。
TPX(nmol/min /mg prot)=(A1-A2)÷ε÷d×V反總÷(Cpr×V樣)÷T
=573×(A1-A2)÷Cpr
(2). 按樣本質(zhì)量計算
活性單位定義:25℃或者37℃中,每克樣本每分鐘催化1nmol H2O2降解為1個酶活單位。
TPX活性(nmol/min/g 鮮重)=(A1-A2)÷ε÷d×V反總÷(W×V樣÷V樣總)÷T
=573×(A1-A2)÷W
(3)按細胞數(shù)量計算
活性單位定義:25℃或者37℃中,每104個細胞每分鐘催化1nmol H2O2降解為1個酶活單位。
TPX活性(nmol/min/104 cell)=(A1-A2)÷ε÷d×V反總÷(細胞數(shù)量×V樣÷V樣總)÷T
=573×(A1-A2)÷細胞數(shù)量
(4)按液體體積計算
活性單位定義:25℃或者37℃中,每毫升液體每分鐘催化1nmol H2O2降解為1個酶活單位。
TPX活性(nmol/min /mL)=(A1-A2)÷ε÷d×V反總÷V樣÷T
=573×(A1-A2)
ε:H2O2的摩爾消光系數(shù),43600 L/mol/cm=0.0436 L/μmol/cm;d:比色皿光徑,1cm;V反總:反應體系總體積(L),200 μ L=2×10-4 L;Cpr:上清液蛋白質(zhì)濃度(mg/mL);W :樣品質(zhì)量;V樣:加入反應體系中上清液體積(mL),4 μL=4×10-3 mL;V樣總:提取液體積,1 mL;T:反應時間(min),2min。
b.使用96孔板測定的計算公式如下
(1). 按蛋白濃度計算
活性單位定義:25℃或者37℃中,每毫克蛋白每分鐘催化1nmol H2O2降解為1個酶活單位。
TPX活性(nmol/min /mg prot)=(A1-A2)÷ε÷d×V反總÷(Cpr×V樣)÷T
=1146×(A1-A2)÷Cpr
(2). 按樣本質(zhì)量計算
活性單位定義:25℃或者37℃中,每克樣本每分鐘催化1nmol H2O2降解為1個酶活單位。
TPX活性(nmol/min/g 鮮重)=(A1-A2)÷ε÷d×V反總÷(W×V樣÷V樣總)÷T
=1146×(A1-A2)÷W
(3)按細胞數(shù)量計算
活性單位定義:25℃或者37℃中,每104個細胞每分鐘催化1nmol H2O2降解為1個酶活單位。
TPX活性(nmol/min/104 cell)=(A1-A2)÷ε÷d×V反總÷(細胞數(shù)量×V樣÷V樣總)÷T
=1146×(A1-A2)÷細胞數(shù)量
(4)按液體體積計算
活性單位定義:25℃或者37℃中,每毫升液體每分鐘催化1nmol H2O2降解為1個酶活單位。
TPX活性(nmol/min /mL)=(A1-A2)÷ε÷d×V反總÷V樣÷T
=1146×(A1-A2)
ε:H2O2的摩爾消光系數(shù),43600 L/mol/cm=0.0436 L/μmol/cm;d:96孔板光徑,0.5cm;V反總:反應體系總體積(L),200 μL=2×10-4 L;Cpr:上清液蛋白質(zhì)濃度(mg/mL);W :樣品質(zhì)量;V樣:加入反應體系中上清液體積(mL),4 μ L=4×10-3 mL;V樣總:提取液體積,1 mL;T:反應時間(min),2min。
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