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γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(γ-GT)試劑盒說明書

發(fā)布時(shí)間:2023/10/16      點(diǎn)擊次數(shù):253

γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶γ-GT試劑盒說明書

                                          微量法100T/96S

 

    意:正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。

測(cè)定意義:

γ-GTγ-谷氨酰循環(huán)中的關(guān)鍵酶,催化GSH降解。γ-GT催化GSH或者其他γ-谷氨?;衔锷系?/span>γ-谷氨?;D(zhuǎn)移到受體。也可以催化GSH和其他γ-谷氨酰基化合物的水解,產(chǎn)生谷氨酸鹽,在細(xì)胞外谷胱甘肽新陳代謝中起了重要的作用。

 

測(cè)定原理:

γ-GT催化谷氨酰對(duì)硝基苯胺中γ-谷氨?;D(zhuǎn)移給N-甘氨酰甘氨酸,生成對(duì)硝基苯胺,在405nm有特征光吸收;通過測(cè)定405nm光吸收增加速率,來計(jì)算γ-GT酶活性。

 

自備儀器和用品:

低溫離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)節(jié)移液器、可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量玻璃比色皿/96孔板、和蒸餾水

 

試劑組成和配制:

試劑一:液體100mL×1瓶,4℃保存。

試劑二:粉劑×1瓶,4℃保存。

試劑三:液體4mL×1瓶,4℃保存。

試劑四:液體14.8mL×1瓶,4℃保存。

工作液(在試劑二瓶中配制):臨用前配制,把試劑三倒入試劑二瓶中,充分溶解(室溫過低時(shí)可以40℃水浴促進(jìn)溶解);然后把試劑四倒入試劑二瓶中,混勻后室溫保存。

 

粗酶液提取:

1.        組織:按照組織質(zhì)量(g:試劑一體(mL)15~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL試劑一)進(jìn)行冰浴勻漿。8000g,4離心15min,取上清,置冰上待測(cè)。

2.        細(xì)菌、真菌:按照細(xì)胞數(shù)量(104個(gè)):試劑一體積(mL)為500~10001的比例(建議500萬細(xì)胞加入1mL試劑一),冰浴超聲波破碎細(xì)胞(功率300w,超聲3秒,間隔7秒,總時(shí)間3min);然后8000g4,離心15min,取上清置于冰上待測(cè)。

3. 血清等液體:直接測(cè)定。

 

γ-GT測(cè)定操作:

1. 分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到405 nm,蒸餾水調(diào)零。

2. 試劑二置于25℃(一般物種)或者37℃(哺乳動(dòng)物)水浴中預(yù)熱30min(保證無沉淀)。

3. 測(cè)定管:取微量玻璃比色皿或96孔板,依次加入20μL上清液,180μL工作液,混勻后于405nm測(cè)定10s70s時(shí)吸光度,記為A1A2

 

γ-GT活性計(jì)算:

標(biāo)準(zhǔn)曲線:y=0.006x+0.0016,x為對(duì)硝基苯胺濃度,y為吸光值,R2=0.999。

 

a.使用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

(1). 按蛋白濃度計(jì)算

活性單位定義:25或者37中,每毫克蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1μmol對(duì)硝基苯胺為1個(gè)酶活單位。

γ-GTμmol/min/mg prot=[ (A2A1)0.0016]÷0.006×V反總÷Cpr×V樣)÷T

=1.67 × [ (A2A1)0.0016] ÷ Cpr

(2). 按樣本質(zhì)量計(jì)算

活性單位定義:25或者37中,每克樣本每分鐘催化產(chǎn)生1μmol對(duì)硝基苯胺為1個(gè)酶活單位。

γ-GTμmol/min/g 鮮重=[ (A2A1)0.0016]÷0.006×V反總÷(W×V÷V樣總)÷T

=1.67 × [ (A2A1)0.0016] ÷W

3)按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

活性單位定義:25或者37中,每104個(gè)細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生1μmol對(duì)硝基苯胺為1個(gè)酶活單位。

γ-GTμmol/min/104 cell=[ (A2A1)0.0016]÷0.006×V反總÷(細(xì)胞數(shù)量×V÷V樣總)÷T

=1.67 × [ (A2A1)0.0016] ÷細(xì)胞數(shù)量

4)按液體體積計(jì)算

活性單位定義:25或者37中,每毫升液體每分鐘催化產(chǎn)生1μmol對(duì)硝基苯胺為1個(gè)酶活單位。

γ-GTμmol/min/mL= [ (A2A1)0.0016]÷0.006×V反總÷V÷T

= 1.67 × [ (A2A1)0.0016]

V反總:反應(yīng)體系總體積(L),200μL=2×10-4LCpr:蛋白濃度(mg/mL);W :樣品質(zhì)量;V樣:反應(yīng)體系中加入上清液體積(mL),20μL=0.02 mLV樣總:提取液體積,1 mL;T:反應(yīng)時(shí)間(min),1min。

b.使用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)曲線:y=0.003x+0.0016x為對(duì)硝基苯胺濃度,y為吸光值,R2=0.999。

 (1). 按蛋白濃度計(jì)算

活性單位定義:25或者37中,每毫克蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1μmol對(duì)硝基苯胺為1個(gè)酶活單位。

γ-GTμmol/min/mg prot=[ (A2A1)0.0016]÷0.003×V反總÷Cpr×V樣)÷T

=3.34× [ (A2A1)0.0016] ÷ Cpr

(2). 按樣本質(zhì)量計(jì)算

活性單位定義:25或者37中,每克樣本每分鐘催化產(chǎn)生1μmol對(duì)硝基苯胺為1個(gè)酶活單位。

γ-GTμmol/min/g 鮮重=[ (A2A1)0.0016]÷0.003×V反總÷(W×V÷V樣總)÷T

=3.34 × [ (A2A1)0.0016] ÷W

3)按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

活性單位定義:25或者37中,每104個(gè)細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生1μmol對(duì)硝基苯胺為1個(gè)酶活單位。

γ-GTμmol/min/104 cell=[ (A2A1)0.0016]÷0.003×V反總÷(細(xì)胞數(shù)量×V÷V樣總)÷T

=3.34 × [ (A2A1)0.0016] ÷細(xì)胞數(shù)量

4)按液體體積計(jì)算

活性單位定義:25或者37中,每毫升液體每分鐘催化產(chǎn)生1μmol對(duì)硝基苯胺為1個(gè)酶活單位。

γ-GTμmol/min/mL= [ (A2A1)0.0016]÷0.003×V反總÷V÷T

= 3.34 × [ (A2A1)0.0016]

V反總:反應(yīng)體系總體積(L),200μL=2×10-4L;Cpr:蛋白濃度(mg/mL);W :樣品質(zhì)量,g;V樣:反應(yīng)體系中加入上清液體積(mL),20μL=0.02 mL;V樣總:提取液體積,1 mLT:反應(yīng)時(shí)間(min),1min

 

注意事項(xiàng):

1.        培養(yǎng)細(xì)胞中γ-GT活性測(cè)定時(shí),細(xì)胞數(shù)目須在300-500萬之間,細(xì)胞中γ-GT的提取時(shí)可加試劑一后

 

2.        研磨或超聲波處理,不能用細(xì)胞裂解液處理細(xì)胞(防止因?yàn)榈鞍踪|(zhì)變性導(dǎo)致酶失活)。

3.        配置好的工作液2周內(nèi)使用完畢。


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