土壤羥胺還原酶(hydroxylamine reductase,HR)試劑盒說明書
微量法100T/48S
注 意:正式測定之前選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。
測定意義:
土壤羥胺還原酶能將土壤中氮代謝過程中形成的中間產(chǎn)物羥胺還原為氨,土壤中的還原態(tài)化合物可作為氫的供體,其強(qiáng)弱影響到土壤氮代謝過程中氮素的氨揮發(fā)損失,間接影響氮肥的利用效率。
測定原理:
硫酸鐵銨中的Fe3+可將羥胺氧化為氮?dú)?,自身被還原為Fe2+,F(xiàn)e2+在弱酸條件下與鄰菲羅琳形成橙紅色配合物,在510nm處有吸收峰,羥胺還原酶作用于羥胺,使配合物形成量減少,510nm處吸光值的減少可反映羥胺還原酶的活性。
自備實(shí)驗用品及儀器:
天平、常溫離心機(jī)、可見分光光度計/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板、震蕩儀、氮吹儀。
試劑組成和配制:
試劑一:液體4mL×1瓶,4℃保存。
試劑二:粉劑×1瓶,4℃保存。臨用前加4mL蒸餾水充分溶解。
試劑三:液體12mL×1瓶,4℃保存。
試劑四:液體8mL×1瓶,4℃保存。
試劑五:液體4mL×1瓶,4℃保存。
試劑六:液體2mL×1瓶,4℃避光保存。
試劑七:液體2mL×1瓶,4℃避光保存。
樣品處理:
新鮮土樣自然風(fēng)干或 37 度烘箱風(fēng)干,過 30~50 目篩。
測定操作表:
空白管 | 對照管 | 測定管 | |
風(fēng)干土樣(g) | 0.02 | 0.02 | |
試劑一(μL) | 40 | 40 | |
蒸餾水(μL) | 40 | ||
試劑二(μL) | 40 | 40 | 40 |
試劑三(μL) | 120 | 120 | 120 |
混勻后,用N2氣流排除管中空氣,立即密封,于30℃反應(yīng)1h | |||
試劑四(μL) | 80 | 80 | 80 |
充分震蕩10min,8000rpm,25℃,離心10min | |||
上清液(μL) | 20 | 20 | 20 |
試劑五(μL) | 40 | 40 | 40 |
試劑六(μL) | 20 | 20 | 20 |
試劑七(μL) | 20 | 20 | 20 |
蒸餾水(μL) | 100 | 100 | 100 |
充分混勻,25℃靜置顯色10min,用蒸餾水調(diào)零,于微量石英比色皿/96孔板測定510nm各管吸光值,分別記為A空白管、A標(biāo)準(zhǔn)管、A對照管、A測定管,△A=A空白管-(A測定管-A對照管)。 |
計算公式:
a. 使用微量石英比色皿測定的計算公式如下
標(biāo)準(zhǔn)曲線:y = 0.185x -0.1828,R2 = 0.9992
酶活定義:每克土壤每天轉(zhuǎn)化1μg羥胺為一個酶活力單位。
HR活性(μg/d /g土樣)=(△A+ 0.1828)÷ 0.185×V反總÷W÷T
= 36.32×(△A+0.1828)÷W
b. 使用96孔板測定的計算公式如下
標(biāo)準(zhǔn)曲線:y = 0.0925x -0.1828,R2 = 0.9992
酶活定義:每克土壤每天轉(zhuǎn)化1μg羥胺為一個酶活力單位。
HR活性(μg/d /g土樣)=(△A+ 0.1828)÷ 0.0925×V反總÷W÷T
=72.64×(△A+0.1828)÷W
V反總:加入提取液體積,0.28mL;W:樣本質(zhì)量,g;T:1/24h
注意事項:
1. 土壤表層溶解氧濃度較大,取樣應(yīng)取表層5cm以下的土壤,否則酶活性較低或者測定不到。
2. 試劑三盡量不要敞口放置,取完立即加蓋擰緊。
3. 反應(yīng)體系最好能用氮吹儀排除溶解氧,若無此裝置,則加入試劑三后立即密封,于30℃反應(yīng)1h。
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