土壤β-木糖苷酶(Solid-β- xylosidase, S-β-XYS)測定試劑盒說明書
微量法100T/48S
注 意 :正式測定之前選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。
測定意義:
β-木糖苷酶(EC3.2.1.37)存在于植物、細菌和真菌等生物體,是催化木聚糖類半纖維素降解的關(guān)鍵酶,產(chǎn)物木糖可作為碳源應(yīng)用于微生物發(fā)酵。另外,β-木糖苷酶還可以作為生物漂白劑應(yīng)用于造紙工業(yè),比傳統(tǒng)的漂白法環(huán)保,具有廣泛的應(yīng)用價值。
測定原理:
S-β-XYS催化對硝基苯酚-β-D-木糖苷產(chǎn)生對硝基苯酚,對硝基苯酚在405nm處有特征吸收峰,測定405nm光吸收增加速率,可計算S-β-XYS活性。
自備實驗用品及儀器:
天平、低溫離心機、可見分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96孔板和蒸餾水。
試劑組成和配制:
提取液:液體100mL×1瓶,4℃保存。
試劑一:液體1mL×1瓶,4℃避光保存。
試劑二:液體10mL×1瓶,4℃保存。
試劑三:液體10mL×1瓶,4℃保存。
粗酶液提?。?/span>
約0.1g鮮土或風(fēng)干土樣,加入1mL提取液進行冰浴勻漿,室溫振蕩提取30min,然后10000g,4℃,離心10min,取上清待測。
測定操作表:
1、 分光光度計/酶標儀預(yù)熱30min,調(diào)節(jié)波長至405nm。
2、 操作表
對照管 | 測定管 | |
樣本(μL) | 40 | 40 |
試劑一(μL) | 10 | |
試劑二(μL) | 80 | 70 |
混勻,45℃水浴20min | ||
試劑三(μL) | 80 | 80 |
混勻,靜置5min,405nm處測定吸光值A,計算ΔA=A測定管-A對照管。每個測定管設(shè)一個對照管。 |
β-木糖苷酶活性計算公式:
a. 用微量石英比色皿測定的計算公式如下
標準曲線:y=13.226x+0.0011,R2=0.9998;x為標準品濃度(μmol/mL),y為吸光值ΔA。
酶活定義:每克土樣每天催化產(chǎn)生1μmol對硝基苯酚的酶量為一個酶活單位。
β-木糖苷酶活性(μmol/d /g 土樣)=(ΔA-0.0011) ÷13.226×V反總÷(V樣÷V樣總×W)÷T
=16.33×(ΔA-0.0011)÷W
V樣總:加入提取液體積,1mL; V反總:反應(yīng)總體積,0.12mL;V樣:反應(yīng)中樣品體積,0.04mL; W:樣品質(zhì)量,g;T:反應(yīng)時間,20min=1/72d;
b.用96孔板測定的計算公式如下
標準曲線:y=6.613x+0.0011,R2=0.9998;x為標準品濃度(μmol/mL),y為吸光值ΔA
酶活定義:每克土樣每天催化產(chǎn)生1μmol對硝基苯酚的酶量為一個酶活單位。
β-木糖苷酶活性(μmol/d /g 土樣)=(ΔA-0.0011) ÷6.613×V反總÷(V樣÷V樣總×W)÷T
=32.66×(ΔA-0.0011)÷W
V樣總:加入提取液體積,1mL; V反總:反應(yīng)總體積,0.12mL;V樣:反應(yīng)中樣品體積,0.04mL; W:樣品質(zhì)量,g;T:反應(yīng)時間,20min=1/72d;
ΔA控制在0.01-1范圍內(nèi),若ΔA大于1,可適當(dāng)減小樣本量。
標準曲線線性范圍為:0.01μmol/mL-0.5μmol/mL。
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