蔗糖磷酸合成酶(Sucrose phosphate synthase,SPS)試劑盒說明書
微量法100管/48樣
注 意 :正式測定管前務(wù)必取2-3個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定
測定意義:
蔗糖不僅是重要的光合產(chǎn)物,也是植物體內(nèi)運輸?shù)闹饕镔|(zhì),還是碳水化合物的貯存形式之一。SPS(EC 2.4.1.14)以果糖-6-磷酸為受體,形成的蔗糖磷酸在蔗糖磷酸酶的作用下形成蔗糖。一般把蔗糖磷酸酯合成酶-蔗糖磷酸酶系統(tǒng)看作是蔗糖合成的主要途徑。
測定原理:
蔗糖磷酸合成酶催化果糖-6-磷酸形成蔗糖磷酸,蔗糖磷酸與間苯二酚反應(yīng)可呈現(xiàn)顏色變化,在480nm下有特征吸收峰,酶活力大小與顏色的深淺成正比。
需自備的的儀器和用品:
可見分光光度計/酶標(biāo)儀、水浴鍋、離心機、移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰
試劑的組成和配制:
提取液:液體100mL×1瓶,4℃保存;
試劑一:液體2.5mL×1瓶,-20℃保存;
試劑二:1000μg/mL蔗糖溶液10mL×1瓶,4℃保存;
試劑三:液體2mL×1瓶,4℃保存
試劑四:液體25mL×1瓶,4℃保存;
試劑五:液體6mL×1瓶,4℃避光保存;
樣品測定的準(zhǔn)備:
按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL提取液),進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測。
測定步驟:
1、 分光光度計或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長至480nm,蒸餾水調(diào)零。
2、 樣本測定,(在EP管中依次加入下列試劑):
試劑名稱(μL) | 測定管 | 對照管 | 標(biāo)準(zhǔn)管 | 空白管 |
樣本 | 10 | 10 | ||
蒸餾水 | 45 | 45 | 55 | |
試劑二 | 10 | |||
試劑一 | 45 |
混勻,25℃準(zhǔn)確水浴10min
試劑三 | 15 | 15 | 15 | 15 |
沸水浴中煮沸10min左右(蓋緊,以防止水分散失),冷卻
試劑四 | 210 | 210 | 210 | 210 |
試劑五 | 60 | 60 | 60 | 60 |
混勻,沸水浴30min,冷卻后,取200μL 至微量石英比色皿或96孔板中,480nm下測定各管吸光值。標(biāo)準(zhǔn)管和空白管只要做一管。每個測定管需要設(shè)一個對照管。
SPS活力單位的計算:
1、按照蛋白濃度計算
單位定義:每mg組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1μg 蔗糖定義為一個酶活力單位。
SPS活性(μg /min/mg prot)= C標(biāo)準(zhǔn)管×V1×(A測定管-A對照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)÷(V1×Cpr)÷T=100×(A測定管-A對照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)÷Cpr
2、按照樣本鮮重計算
單位定義:每g組織每分鐘催化產(chǎn)生1μg 蔗糖定義為一個酶活力單位。
SPS活性(μg /min/g鮮重) = C標(biāo)準(zhǔn)管×V1×(A測定管-A對照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)÷(W×V1÷V2)÷T=100×(A測定管-A對照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)÷W
C標(biāo)準(zhǔn)管:標(biāo)準(zhǔn)管濃度,1000μg/mL;V1:加入反應(yīng)體系中樣本體積,0.01mL; V2:加入提取液體積,1mL;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本鮮重,g;T :反應(yīng)時間:10min。
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