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游離膽固醇(free cholesterol, FC)含量測(cè)定試劑盒說(shuō)明書

發(fā)布時(shí)間:2023/5/10      點(diǎn)擊次數(shù):258

游離膽固醇(free cholesterol, FC)含量測(cè)定試劑盒說(shuō)明書

                                                  微量法100T/96S

 

 

    意:正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。

測(cè)定意義:

FC是構(gòu)成細(xì)胞膜的主要成分,也是合成腎上腺皮質(zhì)激素、性激素膽汁酸維生素D生理活性物質(zhì)的重要原料。FC濃度可作為脂代謝的指標(biāo)。

 

測(cè)定原理:

FC氧化酶催化FC生成4-膽甾烯酮和H2O2,過氧化物酶催化H2O2、4-氨基安替比林和酚生成紅色醌類化合物,在500nm有吸收峰,其顏色深淺與FC含量成正比。

 

自備儀器和用品:

水浴鍋、可調(diào)式移液槍、酶標(biāo)儀、96孔板、異丙醇和蒸餾水。

 

試劑組成和配置:

試劑一:異丙醇100mL(自備);

試劑二:液體20mL×1瓶,4保存;

試劑三:粉劑×1瓶,4保存;

試劑四:液體40μL×1瓶,4保存;

TC標(biāo)準(zhǔn)品:液體1mL×1支,0.5μmol/mL,4保存。

 

FC的提取:

1. 組織:按照組織質(zhì)量(g):試劑一體積(mL)15~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL試劑一)進(jìn)行冰浴勻漿。8000g,4℃離心10min,取上清置冰上待測(cè)。

2.細(xì)菌、真菌:先收集400-500萬(wàn)細(xì)胞或細(xì)菌到離心管內(nèi),棄上清,加1mL試劑一,超聲波破碎1min(強(qiáng)度20%,超聲2s,停1s,即FC待測(cè)液。

3.血清(漿)樣品:直接測(cè)定。

 

 

測(cè)定操作:

1. 酶標(biāo)儀預(yù)熱30 min,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到500 nm。

2. FC工作液的配制:臨用前,吸取約0.8mL試劑二分別加入試劑三和試劑四瓶中,充分溶解后再全部轉(zhuǎn)移回試劑二瓶中,充分混勻,FC工作液置于37水浴10min。用不完的工作液4℃保存一周。

3. 標(biāo)準(zhǔn)管:依次在96孔板中加入20μL FC標(biāo)準(zhǔn)液和180μL FC工作液,混勻,37℃靜置3h后于500nm測(cè)定A標(biāo)準(zhǔn)管。

4. 測(cè)定管:依次在96孔板中加入20μL FC待測(cè)液和180μL FC工作液,混勻,37℃靜置3h500nm測(cè)定A測(cè)定管。

5、空白管:依次在96孔板中加入20μL 試劑一180μL FC工作液,混勻,37℃靜置3h500nm測(cè)定

 

A測(cè)定管。

 

注意事項(xiàng):

1、   標(biāo)準(zhǔn)管和空白管只要做一管。

2、   若測(cè)定管產(chǎn)生白色渾濁,可以將待測(cè)液用異丙醇稀釋2~5倍后測(cè)定,并在最后結(jié)果乘以相應(yīng)倍數(shù)。

 

計(jì)算公式:

1. 血清(漿)中FC含量計(jì)算:

FC含量(μmol /dL= C標(biāo)準(zhǔn)液×A測(cè)定管-A空白管)÷A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)×100mL

=50×A測(cè)定管-A空白管)÷A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)

C標(biāo)準(zhǔn)液:0.5μmol/mL;100 mL1dL=100 mL。

2. 組織中FC含量計(jì)算:

(1)按樣本蛋白濃度計(jì)算

FC含量(μmol / mg prot= C標(biāo)準(zhǔn)液×A測(cè)定管-A空白管)÷A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)÷Cpr

                       = 0.5×A測(cè)定管-A空白管)÷A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)÷Cpr

(2)按樣本鮮重計(jì)算

FC含量(μmol / g 鮮重= C標(biāo)準(zhǔn)液×A測(cè)定管-A空白管)÷A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)÷W

                  = 0.5×A測(cè)定管-A空白管)÷A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)÷W

C標(biāo)準(zhǔn)液:0.5μmol/mL;Cpr樣本蛋白濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g/mL

3. 細(xì)胞、細(xì)菌中FC含量計(jì)算:

FC含量(μmol /104 cell= C標(biāo)準(zhǔn)液×A測(cè)定管-A空白管)÷A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)÷細(xì)菌或細(xì)胞(104 cell /L

=0.5×A測(cè)定管-A空白管)÷A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)÷細(xì)菌或細(xì)胞(104 cell /L

C標(biāo)準(zhǔn)液:0.5μmol/mL

Z低檢出限為1nmol/mL。


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