脂肪酸合成酶(FAS)活性試劑盒說明書
微量法100T/96S
注 意 :正式測定之前選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。
測定意義:
FAS是脂肪酸合成關(guān)鍵酶,催化乙酰輔酶A和丙二酰輔酶A而生成長鏈脂肪酸。FAS普遍表達(dá)于各種組織細(xì)胞中,在哺乳動物肝、腎、腦、肺和乳腺以及脂肪組織中表達(dá)豐富。
測定原理:
FAS催化乙酰CoA、丙二酰CoA和NADPH生成長鏈脂肪酸和NADP+;NADPH在340nm有吸收峰,而NADP+沒有;通過測定340nm 光吸收下降速率,計(jì)算FAS活性。
自備儀器和用品:
研缽、冰、臺式離心機(jī)、紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板、可調(diào)式移液槍和蒸餾水。
試劑組成和配制:
試劑一:液體100mL×1瓶,-20℃保存。用前1d取出置于4℃充分解凍后混勻。
試劑二:粉劑×1瓶。臨用前加入440μL試劑四,充分溶解,用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復(fù)凍融。
試劑三:粉劑×1瓶,4℃保存。臨用前加入440μL試劑四,充分溶解,用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復(fù)凍融。
試劑四:液體20mL×1瓶, 4℃保存。
試劑五:粉劑×1瓶,4℃保存。臨用前加入840μL試劑四,充分溶解,用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復(fù)凍融。
粗酶液提取:
1. 組織:按照組織質(zhì)量(g):試劑一體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL試劑一)進(jìn)行冰浴勻漿。12000g,4℃離心40min,取上清置冰上待測。
2. 細(xì)菌、真菌:按照細(xì)胞數(shù)量(104個):試劑一體積(mL)為500~1000:1的比例(建議500萬細(xì)胞加入1mL試劑一),冰浴超聲波破碎細(xì)胞(功率300w,超聲3秒,間隔7秒,總時間3min);然后12000g,4℃,離心40min,取上清置于冰上待測。
3. 血清等液體:直接測定。
FAS測定操作:
1. 分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min,調(diào)節(jié)波長到340 nm,蒸餾水調(diào)零。
2. 試劑四置于40℃水浴中預(yù)熱30 min。
3. 在96孔板或EP管中依次加入20μL上清液、4μL試劑二、4μL試劑三、164μL試劑四和8μL試劑五,混勻后于340nm處測定吸光值,記錄第30s和90s時吸光值,分別記錄為A1和A2。△A測=A1-A2。
FAS活性計(jì)算:
a. 使用微量石英比色皿測定的計(jì)算公式如下
(1)按照蛋白濃度計(jì)算
活性單位定義:37℃中每毫克蛋白每分鐘氧化1nmol NADPH 為1個酶活單位。
FAS(nmol/min/mg prot) =(△A÷ε÷d×V反總×109) ÷(Cpr×V樣)÷T
=1608×△A÷Cpr
(2)按照樣本質(zhì)量計(jì)算
活性單位定義:37℃中每克組織每分鐘氧化1nmol NADPH 為1個酶活單位。
FAS(nmol/min/g 鮮重) = (△A÷ε÷d×V反總×109) ÷(W×V樣÷V樣總)÷T
=1608×△A ÷W
(3)按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算
活性單位定義:37℃中每104個細(xì)胞每分鐘氧化1nmol NADPH 為1個酶活單位。
FAS(nmol /min/104cell) = (△A÷ε÷d×V反總×109) ÷(細(xì)胞數(shù)量×V樣÷V樣總)÷T
=1608×△A ÷細(xì)胞數(shù)量
(4)按液體體積計(jì)算
活性單位定義:37℃中每毫升樣本每分鐘氧化1nmol NADPH 為1個酶活單位。
FAS(nmol /min/mL) =(△A÷ε÷d×V反總×109) ÷V樣÷T
=1608×△A
ε:NADPH摩爾消光系數(shù),6.22×103L/mol/cm;d:比色皿光徑,1 cm;V反總:反應(yīng)體系總體積,200μL=2×10-4L;Cpr:上清液蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W :樣品質(zhì)量;V樣:加入反應(yīng)體系中上清液體積,20μL=0.02 mL;V樣總:提取液體積,1 mL;T:反應(yīng)時間,1min。
b. 使用96孔板測定的計(jì)算公式如下
(1)按照蛋白濃度計(jì)算
活性單位定義:37℃中每毫克蛋白每分鐘氧化1nmol NADPH 為1個酶活單位。
FAS(nmol/min/mg prot) =(△A÷ε÷d×V反總×109)÷(Cpr×V樣)÷T
=3216×△A÷Cpr
(2)按照樣本質(zhì)量計(jì)算
活性單位定義:37℃中每克組織每分鐘氧化1nmol NADPH 為1個酶活單位。
FAS(nmol/min/g 鮮重) = (△A÷ε÷d×V反總×109) ÷(W×V樣÷V樣總)÷T
=3216×△A÷W
(3)按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算
活性單位定義:37℃中每104個細(xì)胞每分鐘氧化1nmol NADPH 為1個酶活單位。
FAS(nmol /min/104cell) = (△A÷ε÷d×V反總×109)÷(細(xì)胞數(shù)量×V樣÷V樣總)÷T
=3216×△A÷細(xì)胞數(shù)量
(4)按液體體積計(jì)算
活性單位定義:37℃中每毫升樣本每分鐘氧化1nmol NADPH 為1個酶活單位。
FAS(nmol /min/mL) =(△A÷ε÷d×V反總×109 )÷V樣÷T
=3216×△A
ε:NADPH摩爾消光系數(shù),6.22×103L/mol/cm;d:96孔板光徑,0.5 cm;V反總:反應(yīng)體系總體積,200μL=2×10-4L;Cpr:上清液蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W :樣品質(zhì)量;V樣:加入反應(yīng)體系中上清液體積,20μL=0.02 mL;V樣總:提取液體積,1 mL;T:反應(yīng)時間,1min。
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