?;D(zhuǎn)移酶(alcohol acyl transferase,AAT)活性測定試劑盒說明書
微量法100管/96樣
注 意 :正式測定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。
測定意義:
AAT是一個(gè)多功能蛋白大家族,主要負(fù)責(zé)催化生物體內(nèi)各種酰基化和去?;磻?yīng),在基因表達(dá)、代謝和信號傳導(dǎo)中具有重要作用。
測定原理:
AAT催化乙酰CoA轉(zhuǎn)移乙?;蕉〈?,釋放的CoA還原DTNB生成TNB;TNB在412nm有吸收峰,測定412 nm吸光度增加速率可計(jì)算AAT活性。
自備儀器和用品:
研缽、冰、臺式離心機(jī)、可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板、恒溫水浴鍋、無水乙醇。
試劑組成和配制:
提取液:液體100mL×1瓶,4℃保存;
試劑一:液體20mL×1瓶,4℃保存;
試劑二:粉劑×1瓶,-20℃保存。
試劑三:粉劑×1支,4℃避光保存。
粗酶液提?。?/span>
1. 組織:按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL提取液)進(jìn)行冰浴勻漿。8000g,4℃離心10min,取上清置冰上待測。
2. 細(xì)菌、真菌:按照細(xì)胞數(shù)量(104個(gè)):提取液體積(mL)為500~1000:1的比例(建議500萬細(xì)胞加入1mL提取液),冰浴超聲波破碎細(xì)胞(功率300w,超聲3秒,間隔7秒,總時(shí)間3min);然后8000g,4℃,離心10min,取上清置于冰上待測。
3. 液體:直接檢測。
AAT測定操作:
1、分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min,調(diào)節(jié)波長到412 nm,蒸餾水調(diào)零。
2、工作液的配制:臨用前在試劑二瓶中加入18mL試劑一,充分混勻待用。用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復(fù)凍融。
3、試劑三的配制:臨用前加無水乙醇1mL充分溶解待用,用不完的試劑4℃保存。
4、 空白管:在Ep管或96孔板中加入10μL提取液和180μL工作液,充分混勻,35℃反應(yīng)15min,加入10μL試劑三,充分混勻,25℃靜置10min,測定412nm處吸光值,記為A空白管。
5、 測定管:在Ep管或96孔板中加入10μL樣本和180μL工作液,充分混勻,35℃反應(yīng)15min,加入10μL試劑三,充分混勻,25℃靜置10min,測定412nm處吸光值,記為A測定管。△A=A測定管- A空白管,空白管只要做一管。
AAT活性計(jì)算:
a. 使用微量石英比色皿測定的計(jì)算公式如下
(1)按照蛋白濃度計(jì)算
活性單位定義:每毫克蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1nmol TNB定義為一個(gè)酶活單位。
AAT (nmol/min/mg prot) = △A ÷(×d)×V反總÷(V樣×Cpr)÷T = 98.04×△A÷Cpr
(2)按照樣本質(zhì)量計(jì)算
活性單位定義:每克組織每分鐘催化產(chǎn)生1nmol TNB定義為一個(gè)酶活單位。
AAT (nmol/min /g 鮮重) = △A ÷(×d)×V反總÷(W×V樣÷V樣總) ÷T = 98.04×△A÷W
(3)按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算
活性單位定義:每104個(gè)細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生1nmol TNB定義為一個(gè)酶活單位。
AAT (nmol/min/104cell) = △A ÷(×d)×V反總÷(細(xì)胞數(shù)量×V樣÷V樣總) ÷T= 98.04×△A÷ 細(xì)胞數(shù)量
(4)按液體體積計(jì)算
活性單位定義:每毫升樣品每分鐘催化產(chǎn)生1nmol TNB定義為一個(gè)酶活單位。
AAT (nmol/min/mL) = △A ÷(×d)×V反總÷V樣÷T = 98.04×△A
:TNB消光系數(shù),13600L/mol/cm;d:比色皿光徑:1cm;V反總:反應(yīng)總體積,0.2mL;V樣:加入反應(yīng)體系中上清液體積,0.01mL;V樣總:加入提取液體積,1mL;Cpr:蛋白含量,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g;T:反應(yīng)時(shí)間,15 min。
b.使用96孔板測定的計(jì)算公式如下
(1)按照蛋白濃度計(jì)算
活性單位定義:每毫克蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1nmol TNB定義為一個(gè)酶活單位。
AAT (nmol/min/mg prot) = △A ÷(×d)×V反總÷(V樣×Cpr)÷T =196.08×△A÷Cpr
(2)按照樣本質(zhì)量計(jì)算
活性單位定義:每克組織每分鐘催化產(chǎn)生1nmol TNB定義為一個(gè)酶活單位。
AAT (nmol/min /g 鮮重) = △A ÷(×d)×V反總÷(W×V樣÷V樣總) ÷T = 196.08×△A÷W
(3)按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算
活性單位定義:每104個(gè)細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生1nmol TNB定義為一個(gè)酶活單位。
AAT (nmol/min/104cell) = △A ÷(×d)×V反總÷(細(xì)胞數(shù)量×V樣÷V樣總) ÷T=196.08×△A÷ 細(xì)胞數(shù)量
(4)按液體體積計(jì)算
活性單位定義:每毫升樣品每分鐘催化產(chǎn)生1nmol TNB定義為一個(gè)酶活單位。
AAT (nmol/min/mL) = △A ÷(×d)×V反總÷V樣÷T = 196.08×△A
:TNB消光系數(shù),13600L/mol/cm;d:96孔板光徑:0.5cm;V反總:反應(yīng)總體積,0.2mL;V樣:加入反應(yīng)體系中上清液體積,0.01mL;V樣總:加入提取液體積,1mL;Cpr:蛋白含量,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g;T:反應(yīng)時(shí)間,15min。
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