乙醇含量測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)

　　　微量法100管/96樣

注　意：正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義：

酒是含酒精（乙醇）飲料的統(tǒng)稱(chēng)，乙醇是酒的主要成分，是衡量酒質(zhì)量的重要指標(biāo)之一。我國(guó)是世界上Z早發(fā)明釀酒的國(guó)家，也是酒類(lèi)產(chǎn)品消費(fèi)大國(guó)，其消費(fèi)量居世界zhi首。因此，快速、準(zhǔn)確測(cè)定酒中乙醇含量，對(duì)于確保酒的質(zhì)量和保護(hù)消費(fèi)者的健康具有重大意義。

測(cè)定原理：

乙醇在乙醇脫氫酶的催化下氧化脫氫生成乙醛，同時(shí)，NAD 被還原生成 NADH，NADH 在 1-mPMS 的作用下使 WST-8 顯橙黃色，通過(guò) 450 nm 下測(cè)定吸光值變化可測(cè)得乙醇含量。

需自備的儀器和用品：

酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、96 孔板、研缽、冰、蒸餾水。

試劑的組成和配制：

試劑一：液體 12 mL×1 瓶,4℃保存；

試劑二：粉劑×1 瓶, -20℃保存；臨用前加入 6 mL 試劑三充分溶解待用，用不完的試劑分裝后-20℃保存；

試劑三：液體 10 mL×1 瓶,4℃保存；

試劑四：液體 1.5mL×1 管， 4℃避光保存。

乙醇提取：

1.    組織：按照組織質(zhì)量（g）：蒸餾水體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱(chēng)取約 0.1g 組織，加入 1mL 蒸餾水），進(jìn)行勻漿，8000g，25℃離心 10min，取上清待測(cè)。

2.   細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴個(gè)）：蒸餾水體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 蒸餾水），超聲波破碎（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）， 8000g，25℃離心 10min，取上清待測(cè)。

3.   血清（漿）等液體樣品：直接測(cè)定。

測(cè)定步驟：

1.   酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 450nm。

2.   工作液的配制：臨用前按照樣本數(shù)量，按以下比例配制工作液

試劑名稱(chēng)                                       體積（μL）

試劑一                                                 100

試劑二                                                   50

試劑四                                                   10

3.   樣本測(cè)定

按下表在 96 孔板中加入如下試劑

試劑名稱(chēng)                                       體積（μL）

樣本                                                    40

測(cè)定工作液                                              160

混勻后記錄 450nm 下測(cè)定初始吸光值 A1，和 37℃避光孵育 10min 后的吸光值 A2，計(jì)算△A=A2-A1。

乙醇含量計(jì)算：

x 為乙醇含量（μmol/mL），y 為吸光值差值△A。

1.   按照血清（漿）體積計(jì)算

乙醇含量（μmol/mL）= (△A-0.0055)÷0.0256

=39.1×(△A-0.0055)

2.   按照樣品質(zhì)量計(jì)算

乙醇含量（μmol/g 鮮重）= [ (△A-0.0055)÷0.0256×V1]÷(W ×V1÷V2）

=  39.1×(△A-0.0055)÷W

3.   按照細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

乙醇含量（μmol/10⁴ cell）= [ (△A-0.0055)÷0.0256×V1]÷（500×V1÷V2）

=0.078×(△A-0.0055)

V1：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.04mL；V2：加入提取液體積，1 mL； Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500 萬(wàn)；

注意事項(xiàng)：

測(cè)定前取 1-2 個(gè)樣做預(yù)實(shí)驗(yàn)，若△A﹥0.3 或乙醇含量﹥10μmol/mL，需將樣本用蒸餾水稀釋后再測(cè)定，以確保測(cè)定的準(zhǔn)確性。

Z低檢測(cè)限：0.02μmol/mL。