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結(jié)合態(tài)淀粉合成酶(GBSS)試劑盒說(shuō)明書(shū)

發(fā)布時(shí)間:2023/4/8      點(diǎn)擊次數(shù):258

結(jié)合態(tài)淀粉合成酶(Granule-bound starch synthase,GBSS試劑盒說(shuō)明書(shū)

                                      微量法100/96

 

    意:正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義

GBSSEC 2.4.1.21以束縛態(tài)存在于淀粉體中,催化淀粉鏈的加長(zhǎng)反應(yīng),主要負(fù)責(zé)直鏈淀粉的合成。

 

測(cè)定原理

GBSS催化ADPG與淀粉引物(葡聚糖)反應(yīng),將葡萄糖分子轉(zhuǎn)移到淀粉引物上,同時(shí)生成ADP;進(jìn)一步通過(guò)反應(yīng)體系中添加的丙酮酸激酶、己糖激酶和6-磷酸葡萄糖脫氫酶依次催化NADP+還原為NADPH,其中NADPH生成量與前一步反應(yīng)生成的ADP數(shù)量呈正比,通過(guò)340nm下測(cè)定NADPH的增加量,可以計(jì)算GBSS活性。

 

需自備的的儀器和用品

紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。

 

試劑的組成和配制

提取液:液體100mL×2瓶,4保存;

試劑一:40mL×1瓶,4保存;

試劑二:粉劑×1瓶,4保存;臨用前加入14mL試劑一充分混勻備用;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復(fù)凍融

試劑三:粉劑×1瓶,4保存;臨用前加入8mL試劑一充分混勻備用;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復(fù)凍融;

試劑四:粉劑×1瓶,4保存;臨用前加入10mL試劑一充分混勻備用;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復(fù)凍融

試劑五:液體×1支,-20保存;臨用前加入500μL蒸餾水,充分溶解備用;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復(fù)凍融;

試劑六:粉劑×1支,-20保存;臨用前加入500μL蒸餾水,充分溶解備用;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復(fù)凍融;

 

粗酶液制備

稱取0.1~0.2g組織(建議稱取約0.1g組織),加入1mL提取液,冰浴中勻漿。10000g ,4離心10min,棄上清,在沉淀中加入1mL提取液充分混勻,置冰上待測(cè)。

 

測(cè)定步驟

1、分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至340nm,蒸餾水調(diào)零。

2、在EP管中按順序加入下列試劑

試劑名稱μL

測(cè)定管

樣本

75

試劑二

135

混勻,30保溫20 min,置沸水浴中1 min(蓋緊,防止水分散失),冰浴冷卻

試劑三

75

混勻,30保溫30 min,置沸水浴中1 min(蓋緊,防止水分散失),冰浴冷卻,10000g 4離心10min,取上清液(如果一次性測(cè)定樣本較多,可以將試劑四、五和六按比例配成混合液)

上清液

150

試劑四

100

試劑五

5

試劑六

5

混勻后立即340 nm波長(zhǎng)下記錄初始吸光度A1 2min后的吸光度A2,計(jì)算ΔA=A2-A1

注意:試劑二如有沉淀,加入之前要使之充分溶解混勻。

 

GBSS活性計(jì)算

a.使用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下:

1、按樣本蛋白濃度計(jì)算:

單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1nmol NADPH定義為一個(gè)酶活力單位。

GBSSnmol/min/mg prot)=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷(V×Cpr) ÷T×稀釋倍數(shù)

 =529×ΔA÷Cpr

此法需要自行測(cè)定樣本蛋白質(zhì)濃度。

2、按照樣本鮮重計(jì)算

單位的定義:每g組織每分鐘催化產(chǎn)生1nmol NADPH定義為一個(gè)酶活力單位。

GBSS活性(nmol/min /g 鮮重=[ΔA×V反總÷ε×d×109W× V÷V樣總)÷T×稀釋倍數(shù)=529×ΔA÷W

V 反總:反應(yīng)體系總體積,2.6×10-4 LεNADPH摩爾消光系數(shù),6.22×103 L / mol /cm;d:比色皿光徑,1cmV樣:加入樣本體積,0.075 mL;V樣總:加入提取液體積,1 mL;T:反應(yīng)時(shí)間,2 min;稀釋倍數(shù):1.9;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量。

 

b.使用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下:

1、按樣本蛋白濃度計(jì)算:

單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1nmol NADPH定義為一個(gè)酶活力單位。

GBSSnmol/min /mg prot)=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷(V×Cpr) ÷T×稀釋倍數(shù)

  =1059×ΔA÷Cpr

此法需要自行測(cè)定樣本蛋白質(zhì)濃度。

2、按照樣本鮮重計(jì)算

單位的定義:每g組織每分鐘催化產(chǎn)生1nmol NADPH定義為一個(gè)酶活力單位。

GBSS活性(nmol/min /g 鮮重=[ΔA×V反總÷ε×d×109W× V÷V樣總)÷T×稀釋倍數(shù) =1059×ΔA÷W

V 反總:反應(yīng)體系總體積,2.6×10-4 LεNADPH摩爾消光系數(shù),6.22×103 L / mol /cmd96孔板光徑,0.5cm;V樣:加入樣本體積,0.075 mL;V樣總:加入提取液體積,1 mLT:反應(yīng)時(shí)間,2 min;稀釋倍數(shù):1.9Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mLW:樣本質(zhì)量。


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