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谷氨酸合成酶(GOGAT)試劑盒說明書

發(fā)布時間:2023/4/5      點擊次數(shù):269

谷氨酸合成酶(Glutamate synthase,GOGAT)試劑盒說明書

                                         微量法100/96

    意:正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定

測定意義:                          

GOGAT廣泛分布于植物中,和谷氨酰胺合成酶共同構成GS/GOGAT循環(huán),參與氨同化的調(diào)控。

 

測定原理:

GOGAT催化谷氨酰胺的氨基轉移到α-酮戊二酸,形成兩分子的谷氨酸;同時NADH氧化生成NAD+,340nm吸光度的下降速率可以反映GOGAT活性大小。

 

需自備的儀器和用品:

紫外分光光度計/酶標儀、臺式離心機、水浴鍋、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。

 

試劑組成和配制:

提取液:液體100mL×1瓶,4保存;

試劑一:液體20mL×1瓶,4保存;

試劑二:粉劑×2,4保存;

 

粗酶液提?。?/span>

細菌或培養(yǎng)細胞:先收集細菌或細胞到離心管內(nèi),離心后棄上清;按照細菌或細胞數(shù)量(104個):提取液體積(mL)為500~10001的比例(建議500萬細菌或細胞加入1mL提取液),超聲波破碎細菌或細胞(冰浴,功率20%或200W,超聲3s,間隔10s,重復30次);8000g 4離心10min,取上清,置冰上待測。

組織:按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)15~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL提取液),進行冰浴勻漿。8000g 4離心10min,取上清,置冰上待測。

 

測定步驟:

1、  分光光度計或酶標儀預熱30min以上,調(diào)節(jié)波長至340nm,蒸餾水調(diào)零。

2、  樣本測定

(1)在試劑二中加入9mL試劑一充分溶解混勻,置于37℃(哺乳動物)或25℃(其它物種)水浴5min;

 

現(xiàn)配現(xiàn)用(配好后3h內(nèi)用完);

2)在微量石英比色皿或96孔板中加入20μL樣本和180μL試劑二,混勻,立即記錄340nm20s時的吸光值A1 5min20s后的吸光值A2,計算ΔA=A1-A2。

GOGAT活性計算:

a.用微量石英比色皿測定的計算公式如下

1)按樣本蛋白濃度計算:

單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘消耗1 nmolNADH定義為一個酶活力單位。

GOGATnmol/min/mg prot)=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷(V×Cpr) ÷T=321×ΔA÷Cpr

2)按樣本鮮重計算:

單位的定義:每g組織每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個酶活力單位。

GOGATnmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷(W ×V÷V樣總) ÷T=321×ΔA÷W

3)按細菌或細胞密度計算:

單位的定義:每1萬個細菌或細胞每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個酶活力單位。

GOGATnmol/min/104 cell)=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷(500×V÷V樣總) ÷T=0.642×ΔA

V反總:反應體系總體積,2×10-4 L;εNADH摩爾消光系數(shù),6.22×103 L / mol /cm;d:比色皿光徑,1cm;V樣:加入樣本體積,0.02 mLV樣總:加入提取液體積,1 mL;T:反應時間,5 min;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g;500:細菌或細胞總數(shù),500萬。

 

b.96孔板測定的計算公式如下

1)按樣本蛋白濃度計算:

單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘消耗1 nmolNADH定義為一個酶活力單位。

GOGATnmol/min/mg prot)=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷(V×Cpr) ÷T=643×ΔA÷Cpr

2)按樣本鮮重計算:

單位的定義:每g組織每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個酶活力單位。

GOGATnmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷(W× V÷V樣總) ÷T=643×ΔA÷W

3)按細菌或細胞密度計算:

單位的定義:每1萬個細菌或細胞每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個酶活力單位。

GOGATnmol/min/104 cell)=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷(500×V÷V樣總)÷T=1.286×ΔA

V反總:反應體系總體積,2×10-4 L;εNADH摩爾消光系數(shù),6.22×103 L / mol /cm;d96孔板光徑,0.5cm;V樣:加入樣本體積,0.02 mL;V樣總:加入提取液體積,1 mL;T:反應時間,5 min;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g;500:細菌或細胞總數(shù),500萬。


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