雙縮脲法蛋白質(zhì)含量測(cè)定試劑盒說明書
微量法100T/96S
注 意:正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定,確保蛋白濃度在1~10mg/ml范圍內(nèi)。
測(cè)定意義:
樣品可溶性蛋白質(zhì)含量常常用于酶活性計(jì)算。此外,可溶性蛋白質(zhì)含量也用于食品等質(zhì)量分析。
測(cè)定原理:
強(qiáng)堿性溶液中,雙縮脲與CuSO4形成紫色絡(luò)合物;紫色絡(luò)合物顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比,而與蛋白質(zhì)分子量及氨基酸成分無關(guān),故可用來測(cè)定蛋白質(zhì)含量。該方法測(cè)定范圍為1~10mg蛋白質(zhì),適用于蛋白質(zhì)濃度高的樣品,尤其是動(dòng)物材料。
自備儀器和用品:
離心機(jī)、可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板、移液器和蒸餾水。
試劑組成和配制:
試劑一:液體20mL×1瓶,4℃保存。
標(biāo)準(zhǔn)品:液體1mL×1瓶,5 mg/mL,4℃保存。
樣品中可溶性蛋白質(zhì)提取:
1. 液體樣品:澄清無色液體樣品可以直接測(cè)定。
2. 組織樣品:按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL提取液(自備,根據(jù)需要選用酶提取緩沖液或者蒸餾水或者生理鹽水))
冰浴勻漿,8000g,4℃離心10min,取上清,即待測(cè)液。(動(dòng)物樣品常常需要稀釋)
3. 細(xì)菌、真菌:按照細(xì)胞數(shù)量(104個(gè)):提取液體積(mL)為500~1000:1的比例(建議500萬細(xì)胞加入1mL提取液),冰浴超聲波破碎細(xì)胞(功率300w,超聲3秒,間隔7秒,總時(shí)間3min);然后8000g,4℃,離心10min,取上清置于冰上待測(cè)。
測(cè)定操作:
1. 分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30 min,調(diào)節(jié)波長到540 nm,蒸餾水調(diào)零。
2. 空白管:取0.5mL EP管,加入40μL蒸餾水,200μL試劑一,混勻后室溫靜置15 min,取200μL于微量玻璃比色皿/96孔板,540nm比色,記為A空白管。
3. 標(biāo)準(zhǔn)管:取0.5mL EP管,加入40μL標(biāo)準(zhǔn)液,200μL試劑一,混勻后室溫靜置15 min,取200μL于微量玻璃比色皿/96孔板,540 nm比色,記為A標(biāo)準(zhǔn)管。
4. 測(cè)定管:取0.5mL EP管,加入40μL待測(cè)液,200μL試劑一,混勻后室溫靜置15 min,取200μL于微量玻璃比色皿/96孔板,540nm比色,記為A測(cè)定管。
注意:空白管和標(biāo)準(zhǔn)管只需測(cè)定一次。
樣品中蛋白質(zhì)濃度計(jì)算公式:
C待測(cè)(mg/mL)= C標(biāo)準(zhǔn)管×(A測(cè)定管-A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)
=5×(A測(cè)定管-A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)
注意事項(xiàng):
1.樣品蛋白濃度須在1~10mg/ml范圍內(nèi),低于1mg/ml不能用此法,高于10mg/ml須做相應(yīng)稀釋。因此測(cè)定前用1~2個(gè)樣做預(yù)實(shí)驗(yàn),確保蛋白濃度在1~10mg/ml范圍內(nèi)。
2.待測(cè)樣品蛋白提取可用生理鹽水、雙蒸水或不含蛋白的PBS提取。該法受硫酸銨、Tris緩沖液干擾,提取液中應(yīng)不含這些物質(zhì);否則改用BCA蛋白質(zhì)含量測(cè)定試劑盒。
電話
微信掃一掃