羥脯氨酸(Hydroxyproline,HYP)試劑盒說明書
微量法100T/96S
注 意:正式測定之前選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。
測定意義:
HYP是機體膠原蛋白主要成分之一,膠原蛋白大多分布于皮膚、腱、軟骨和血管等,因此HYP含量是反映膠原組織代謝及纖維化程度的一項重要指標(biāo)。
測定原理:
樣品經(jīng)水解產(chǎn)生游離的HYP,進(jìn)一步被氯胺T氧化,氧化產(chǎn)物與對二甲氨基苯j(luò)ia醛反應(yīng),產(chǎn)生紅色化合物,在560nm處有特征吸收峰。通過測定樣品水解液560nm吸光值,可計算HYP含量。
自備實驗用品及儀器:
天平、烘箱、玻璃管、離心機、水浴鍋、可見分光光度計/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板、無水乙醇、異丙醇、6mol/L鹽酸和蒸餾水。
試劑組成和配制:
組織提取液:6mol/L鹽酸,自備。濃鹽酸:H2O(V/V)= 1:1,室溫保存。
細(xì)胞提取液:液體100mL×1瓶,4℃保存。
試劑一:液體6mL×1瓶,4℃避光保存。
試劑二:液體6mL×1瓶,4℃避光保存。
羥脯氨酸提?。?/span>
1. 組織:稱取約0.2g樣品于玻璃管,加入2mL的組織提取液,置于110℃烘箱,水解6至12小時,用提取液定容至2mL,12000g,25℃,離心20min,取上清待測。
2. 細(xì)胞:取約500萬個細(xì)胞,加入1mL的細(xì)胞提取液,于高壓消毒器中15磅保持30min,自然降壓后待測。
3. 血清游離羥脯氨酸提?。喝?/span>0.1mL血清,加入0.5mL無水乙醇使蛋白質(zhì)沉淀,8000g4℃離心5min。將上清倒入另一個EP管,氮吹或沸水浴將乙醇揮發(fā)干。冷卻后再加入0.2mL50%異丙醇,充分溶解混勻待測。
測定操作表:
1、 分光光度計/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min,調(diào)節(jié)波長至560nm,蒸餾水調(diào)零。
2、 操作表
對照管 | 測定管 | |
樣本(µL) | 60 | |
試劑一(µL) | 60 | 60 |
混勻,室溫靜置20min | ||
試劑二(µL) | 60 | 60 |
H2O(µL) | 180 | 120 |
混勻,60℃,20min,取出后25℃靜置15 min,取200µL于微量石英比色皿/96孔板中檢測560nm處吸光值。ΔA=A測定-A對照 |
羥脯氨酸含量計算公式:
a. 用微量石英比色皿測定的計算公式如下
標(biāo)準(zhǔn)曲線:y=64.875x+ 0.0251,R2=0.9991
(1)按樣品重量計算
組織羥脯氨酸含量(mg/g 鮮重)=(ΔA-0.0251)÷64.875×V反總÷(V樣÷V樣總×W)
= 0.154×(ΔA-0.0251)÷W
(2)按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算
細(xì)胞羥脯氨酸含量(mg/104 cell)=(ΔA-0.0251)÷64.875×V反總÷V樣×V樣總÷細(xì)胞數(shù)量(萬個)= 0.077×(ΔA-0.0251)÷ 細(xì)胞數(shù)量(萬個)
(3)按血清體積計算
HYP含量(mg/mL)=(ΔA-0.0251)÷ 64.875×V反總÷V樣×2
=0.154×(ΔA-0.0251)
V反總:反應(yīng)總體積,0.3 mL;V樣:反應(yīng)中樣品體積,0.06mL;V樣總:加入提取液體積, mL;W:樣本重量,g
b.用96孔板測定的計算公式如下
標(biāo)準(zhǔn)曲線:y=32.4375x+ 0.0251,R2=0.9991
(1)按樣品重量計算
HYP含量(mg/g 鮮重)=(ΔA-0.0251)÷32.4375×V反總÷(V樣÷V樣總×W)
= 0.308×(ΔA-0.0251)÷W
(2)按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算
HYP含量(mg/104 cell)=(ΔA-0.0251)÷32.4375×V反總÷V樣×V樣總÷細(xì)胞數(shù)量(萬個)= 0.154×(ΔA-0.0251)÷細(xì)胞數(shù)量(萬個)
(3)按血清體積計算
HYP含量(mg/mL)=(ΔA-0.0251)÷32.4375×V反總÷V樣×2
= 0.308×(ΔA-0.0251)
V反總:反應(yīng)總體積,0.3 mL;V樣:反應(yīng)中樣品體積,0.06mL;V樣總:加入提取液體積, mL;W:樣本重量,g;2,血清吹干后復(fù)溶的倍數(shù)。
注意事項:
1、 吸光值大于0.8,樣品適當(dāng)稀釋再測定,注意計算公式里乘以稀釋倍數(shù)。
2、 試劑有一定的毒性,請操作時做好防護(hù)措施,防止吸入或與皮膚接觸。
3、 Z低檢出限為3.8mg/L。
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