馬流行性感冒病毒RT-PCR檢測試劑盒

產(chǎn)品名稱：馬流行性感冒病毒RT-PCR檢測試劑盒

英文名稱：Method of the real-time RT-PCR for the detection of Equine Influenza Virus (50 reactions)

馬流感是馬、驢和騾的一種急性呼吸道疫病，由正黏病毒科 A 型流感病毒屬中的兩個(gè) A 型流感病毒亞型引起，分別為H7N7（曾稱為馬-1 型）和 H3N8（曾稱為馬-2 型）。禽liu感病毒被認(rèn)為是兩種亞型馬流感病毒的祖先，易感馬科動(dòng)物的臨診癥狀表現(xiàn)為發(fā)熱、刺耳地干咳和鼻流黏性膿性分泌物。

本試劑盒是依據(jù)OIE3.5.7 章馬流感診斷國際標(biāo)準(zhǔn)中馬流感國際參考實(shí)驗(yàn)室推薦的針對M 基因可以同時(shí)監(jiān)測H7N7 和H3N8 等馬流感病毒亞型的引物和探針序列，優(yōu)化反應(yīng)參數(shù)配套生產(chǎn)，探針的 5` 端和 3`端分別標(biāo)記不同的熒光素，如 5`端標(biāo)記 FAM 熒光素，3`端是 TAMRA 修飾。

【試劑組成】

3、 樣本采集,存放及運(yùn)輸

3.1  樣本采集：所用取樣器材必須經(jīng)高壓滅菌并烘干。

用于檢測多種樣本（如肌肉、臟器、鼻或咽喉拭子、血清或血漿、組織滲出液等）中馬流感病毒的 RNA。

3.2 存放：樣品應(yīng)盡快研磨提取核酸進(jìn)行檢測，-70 ℃以下可長期保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

3.3  運(yùn)輸：采用冰壺或泡沫箱加冰密封進(jìn)行運(yùn)輸。

4、 熒光 RT-PCR 檢測

4.1 操作方法

4.1.1 樣本的處理（在樣本制備進(jìn)行）：

4.1.1.1  取 n 個(gè)滅菌的 1.5 mL Eppendorf 管，其中 n 為被檢樣品、陽性對照與陰性對照的和（陽性對照、陰性對照在試劑盒中已標(biāo)出），做標(biāo)記。(注：試劑盒中的陽性對照吹打混勻后直接作為PCR 檢測的模板，無需提取核酸)

4.1.1.2  每管加入 600 mL 裂解液，分別加入被檢樣本、陰性對照、陽性對照各 200 mL，一份樣本換用一個(gè)吸頭，再加入 200 mL 氯仿，混勻器上振蕩混勻 5 s（不能過于強(qiáng)烈，以免產(chǎn)生乳化層， 也可以用手顛倒混勻），于 4℃ 12 000 r/min 離心 15 min。

4.1.1.3  取與 4.1.1.1 相同數(shù)量滅菌的 1.5 mL Eppendorf 管，加入 500 mL 異丙醇（-20℃預(yù)冷）， 做標(biāo)記。吸取 4.1.1.2 各管中的上清液轉(zhuǎn)移至相應(yīng)的管中，上清液應(yīng)至少吸取 500mL，不能吸出中間層，顛倒混勻。

4.1.1.4  于 4 ℃、12 000 r/min 離心 15 min（Eppendorf 管開口保持朝離心機(jī)轉(zhuǎn)軸方向放置），小心倒去上清，倒置于吸水紙上，沾干液體(不同樣品須在吸水紙不同地方沾干)；加入 600 mL 75％ 乙醇，顛倒洗滌。

4.1.1.5  于 4 ℃、12 000 r/min 離心 10 min（Eppendorf 管開口保持朝離心機(jī)轉(zhuǎn)軸方向放置），小心倒去上清，倒置于吸水紙上，盡量沾干液體（不同樣品須在吸水紙不同地方沾干）。

4.1.1.6   4 000 r/min 離心 10s（Eppendorf 管開口保持朝離心機(jī)轉(zhuǎn)軸方向放置），將管壁上的殘余液體甩到管底部，小心倒去上清，用微量加樣器將其吸干，一份樣本換用一個(gè)吸頭，吸頭不要碰到有沉淀一面，室溫干燥 3 min，不能過于干燥，以免 RNA 不溶。

4.1.1.7   加入 33 mL DEPC 水，輕輕混勻，溶解管壁上的 RNA，2 000 r/min 離心 5 s，冰上保存?zhèn)溆谩Ｌ崛〉?RNA 須在 2 h 內(nèi)進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增；若需長期保存須放置-70 ℃冰箱內(nèi)。

【推薦使用《《病毒基因組 DNA/RNA 離心柱型提取試劑盒》》，更方便快捷高效提取核酸】。注：提取的 RNA 須在 2 h 內(nèi)進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增；若需長期保存須放置-70 ℃冰箱內(nèi)。

4.1.2          檢測

4.1.2.1 擴(kuò)增試劑準(zhǔn)備（在反應(yīng)混合物配制區(qū)進(jìn)行）：

從試劑盒中取出相應(yīng)的熒光 RT-PCR 反應(yīng)液、酶混合物，在室溫下融化后，2000 r/min 離心 5 s。設(shè)所需熒光 RT-PCR 檢測總數(shù)為 n，其中 n 為被檢樣品、陽性對照與陰性對照的和，每個(gè)樣品測試反應(yīng)體系配制見表 2：

表 2 每個(gè)樣品測試反應(yīng)體系配制表

根據(jù)測試樣品的數(shù)量計(jì)算好各試劑的使用量，加入到適當(dāng)體積試管中，充分混合均勻，向每個(gè)熒光RT-PCR管中各分裝15mL，轉(zhuǎn)移至樣本處理區(qū)。

4.1.2.2  加樣（樣本處理區(qū)進(jìn)行）：

在各設(shè)定的熒光RT-PCR管中分別加入上述樣本處理步驟4.1.1.7中制備的RNA溶液各10 mL，蓋緊管蓋，500 r/min離心30 s。（陽性對照不需要提取核酸，可以直接吹打混勻后吸取當(dāng)模板）

4.1.2.3  熒光 RT-PCR 檢測（在檢測區(qū)進(jìn)行）：

將4.1.2.2中離心后的PCR管放入熒光RT-PCR檢測儀內(nèi)，記錄樣本擺放順序。循環(huán)條件設(shè)置：

第一階段，反轉(zhuǎn)錄 42℃/30 min； 第二階段，預(yù)變性 94℃/2 min；

第三階段，94℃ /15sec，55℃/10 sec, 60℃/30 sec 共 40 個(gè)循環(huán).。熒光收集在第三階段每

次循環(huán)的 60℃延伸時(shí)進(jìn)行。

試驗(yàn)檢測結(jié)束后，根據(jù)收集的熒光曲線和Ct值判定結(jié)果。

4.2  結(jié)果判定

4.2.1  結(jié)果分析條件的設(shè)定 閾值設(shè)定原則：根據(jù)儀器噪聲情況進(jìn)行調(diào)整，以閾值線剛好超過陰性對照品擴(kuò)增曲線的最高點(diǎn)為準(zhǔn)。對于多通道熒光 PCR 儀，選定 FAM(465-510)檢測通道讀取檢測結(jié)果， ABI 儀器選擇 5’FAM; 3’TAMRA 淬滅基團(tuán)。

4.2.2 質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)

a)  陰性對照無 Ct 值并且無擴(kuò)增曲線。

b)  陽性對照的 Ct 值應(yīng)小于等于 30，并出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線。

c)  如陰性和陽性對照不滿足以上條件，此次實(shí)驗(yàn)視為無效。

4.2.3 結(jié)果判定

a)  陰性：無 Ct 值，且無特征性擴(kuò)增曲線，表明樣品為陰性。

b)  陽性：Ct 值≤40.0，且出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，表示樣品為陽性，含有馬流感病毒核酸。

【注意事項(xiàng)】

1.  實(shí)驗(yàn)室應(yīng)至少分三個(gè)區(qū)：樣品處理區(qū)、反應(yīng)混合物配制區(qū)和檢測區(qū)。

2.  各區(qū)物品均為專用，不得交叉使用，避免污染。檢測結(jié)束后，應(yīng)立即對工作臺進(jìn)行清潔。

3.  分裝反應(yīng)液時(shí)，應(yīng)盡量避免產(chǎn)生氣泡。上機(jī)前注意檢查各反應(yīng)管是否蓋緊，以免熒光物質(zhì)泄露污染儀器。

4.  陽性對照在吸取前應(yīng)在微量漩渦振蕩器上劇烈振蕩 1～2 秒。

5.  試劑盒中各組分應(yīng)避免反復(fù)凍融。

【規(guī)格】  50 份/盒

 【貯藏與有效期】熒光 RT-PCR 檢測試劑盒-20℃保存，有效期為 12 個(gè)月；《病毒基因組 DNA/RNA 離心柱型提取試劑盒》室溫保存。