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腸道病毒通用染料法熒光定量RT-PCR試劑盒

簡(jiǎn)要描述:腸道病毒通用染料法熒光定量RT-PCR試劑盒腸道病毒(Enterovirus,EV)是一種RNA病毒,會(huì)引起甲型肝炎,甲型肝炎的潛伏期為15~45天,甲肝病毒散發(fā)時(shí)以小兒為最多,常表現(xiàn)為食欲減退,厭油,消化不良等。

  • 更新時(shí)間:2024-07-18
  • 廠商性質(zhì):生產(chǎn)廠家
  • 生產(chǎn)地址:上海
  • 訪  問  量:221

詳細(xì)介紹

品牌YLKBIO貨號(hào)YLK10375P
規(guī)格50T供貨周期現(xiàn)貨
主要用途科研實(shí)驗(yàn)應(yīng)用領(lǐng)域化工,生物產(chǎn)業(yè)
英文名稱Enterovirus(EV) SYBR qRT-PCR Kit保存條件低溫運(yùn)輸,-20℃保存
有效期12個(gè)月試劑盒說明不同批號(hào)的試劑盒組分不可交互使用

腸道病毒通用染料法熒光定量RT-PCR試劑盒


商品名稱:腸道病毒通用染料法熒光定量RT-PCR試劑盒

Name     :Enterovirus(EV) SYBR qRT-PCR Kit

腸道病毒(Enterovirus,EV)是一種RNA病毒,會(huì)引起甲型肝炎,甲型肝炎的潛伏期為15~45天,甲肝病毒散發(fā)時(shí)以小兒為最多,常表現(xiàn)為食欲減退,厭油,消化不良等。一旦甲肝出現(xiàn)黃疸,出發(fā)癥狀開始明顯減輕,胃納好轉(zhuǎn),肝大有腫痛,部分病例有脾大,血清膽/紅素在病后1-2周內(nèi)為最高,黃疸可持續(xù)2-6周,約1個(gè)月左右即消退,因此腸道病毒的快速準(zhǔn)確鑒定對(duì)該病的預(yù)防和檢疫有著重要作用。本產(chǎn)品基于PCR原理開發(fā)。它具有下列特點(diǎn):

1.一站式,用于不需要單獨(dú)準(zhǔn)備每種成分,包括引物和對(duì)照。

2.根據(jù)腸道病毒的保守基因序列設(shè)計(jì)的引物,具有良好的特異性。

3. 基于染料法qRT-PCR檢測(cè),靈敏度比常規(guī)RT-PCR高10-100倍,可以達(dá)到至少1000拷貝/反應(yīng)。

4.使用一管式qRT-PCR技術(shù),RT和PCR兩步在一個(gè)試管內(nèi)完成,不需要中間轉(zhuǎn)移樣品,降低了操作誤差和可能的污染。

5.本產(chǎn)品足夠50次30μL體系的RT-PCR,只能用于科研,不能用于臨床。


【試劑組成】

 

十孔盒包裝

2×qRT-PCR 緩沖液

500 μL(棕色管)

10×qRT-PCR酶混合液

100 μL(紅蓋)

 ROX染料I

50 μL(棕色管)

ROX染料II

50   μL(棕色管)

熒光PCR專用模板稀釋液

1mL(亮黃蓋)

腸道病毒RT-PCR引物混合液

100   μL(白蓋)

腸道病毒RT-PCR陽性對(duì)照

1×10E8拷貝/μL

50   μL(黃蓋)

核酸釋放劑試用裝

20次(1mL,綠蓋)

使用手冊(cè)

1

【儲(chǔ)存條件及有效期】

低溫運(yùn)輸,-20℃保存,保存期限為12個(gè)月。陽性對(duì)照需要因易污染其他成分需要單獨(dú)放置。本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對(duì)照,只提供RNA片段作為陽性對(duì)照。


【自備試劑】樣品RNA


【使用方法】

一、稀釋陽性對(duì)照(以10E2-10E76個(gè)10倍稀釋度為例。由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高,因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行)。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原。

1.       標(biāo)記6個(gè)離心管,分別為7,6,5,4,32。用帶芯槍頭分別加入45 μL 熒光PCR專用模板稀釋液,最好用帶芯槍頭,下同)。

2.      7號(hào)管中加入5 μL 1×10E8拷貝/μL 的陽性對(duì)照(本試劑盒提供),充分震蕩1分鐘,得1×10E7拷貝/μL的陽性對(duì)照。放冰上待用。

3.      換槍頭,在6號(hào)管中加入5 μL 1×10E7拷貝/μL 的陽性對(duì)照(上步稀釋所得),充分震蕩1分鐘,得1×10E6拷貝/μL的陽性對(duì)照。放冰上待用。

4.      換槍頭,在5號(hào)管中加入5 μL 1×10E6拷貝/μL 的陽性對(duì)照(上步稀釋所得),充分震蕩1分鐘,得1×10E5拷貝/μL的陽性對(duì)照。放冰上待用。重復(fù)上面的操作直到得到6個(gè)稀釋度的陽性對(duì)照。放冰上待用。

二、樣品RNA的制備

5.       如果有N個(gè)樣品,必須設(shè)置N+2個(gè)提取,多出的一個(gè)是PC(樣品制備陽性對(duì)照),一個(gè)是NC(樣品制備陰性對(duì)照)。可以用10μL上步制備的陽性對(duì)照梯度稀釋液中的第4號(hào)(濃度為10E4拷貝/μL,10μL相當(dāng)于1萬拷貝)再加上一定量的水作為制備的陽性對(duì)照(加水后其總體積跟樣品一樣,樣品體積多少取決于所用試劑盒的要求)??梢杂盟鳛橹苽涞年幮詫?duì)照。

6.      用自選方法純化N+2個(gè)樣品的RNA,本試劑盒跟市場(chǎng)上大多數(shù)病毒RNA提取試劑盒兼容。

三、設(shè)置RT-PCR反應(yīng)(20μL體系,在樣品制備室進(jìn)行)

7.       如果做定量分析并且只做1次重復(fù),則標(biāo)記N+9個(gè)PCR管,其中N+2個(gè)用于上步得到的N+2個(gè)樣品,1個(gè)用于PCR陰性對(duì)照,6個(gè)用于標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果做定性分析,并且只做1次重復(fù),則標(biāo)記N+4個(gè)PCR管,其中N+2個(gè)用于上步得到的N+2個(gè)樣品,1個(gè)用于PCR陰性對(duì)照(用水做模板),1個(gè)用于PCR陽性對(duì)照(用第4號(hào)陽性對(duì)照稀釋液做模板)。下面只描述定量分析的步驟,定性分析只是把6個(gè)標(biāo)曲反應(yīng)縮減成1個(gè),其余不變。

8.      在標(biāo)記管中按下表加入各成分(本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對(duì)照設(shè)置完畢后才設(shè)置陽性對(duì)照,陽性對(duì)照樣品要等所有管子蓋上蓋子后最后加):

成分

N+2個(gè)制備所得樣品

RT-PCR陰性對(duì)照

RT-PCR陽性

對(duì)照(2-7管)

2×qRT-PCR 緩沖液

10μL

10μL

10μL

口蹄疫病毒RT-PCR

引物混合物

2μL

2μL

2μL

50×ROX (見注)

0.4μL

0.4μL

0.4μL

 樣品制備所得RNA模板(來于第8步)

5.6μL

不加

不加

稀釋所得6個(gè)陽性對(duì)照(來于第6步)

不加

不加

5.6μL2號(hào)樣到2號(hào)管,3號(hào)樣到3號(hào)管

10×qRT-PCR

酶混合液

2μL

2μL

2μL

:需使用ROX染料I的機(jī)型:ABI Prism7000、73007700、7900HT、Step-One、Step-One Plus

需使用ROX染料II的機(jī)型::ABI Prism 7500、7500FastMJ ResearchChromo4、OpticonIICorbett Rotor Gene 3000。

不需要使用ROX的機(jī)型:Thermal Cycle Dice Real Time System LightCycler、Smart Cycler System、Agilent Mx3000P、RotorGene 3000、RotorGene 6000

9.       上機(jī)后按下面參數(shù)進(jìn)行RT-PCR(參數(shù)可能會(huì)因儀器不同而需優(yōu)化)。

過程

溫度

時(shí)間

RT(逆轉(zhuǎn)錄)

50℃

15-30分鐘

預(yù)變性

94℃

2分鐘

RT - PCR反應(yīng)

30個(gè)循環(huán))

95℃

15

60

15 秒(采集FAM通道的熒光信號(hào))

72

15

按儀器預(yù)設(shè)程序進(jìn)行溶解曲線分析








四、數(shù)據(jù)處理

10.       如果把本試劑盒用于定量檢測(cè),則以陽性對(duì)照濃度的log值為橫軸,以Ct值為縱軸,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測(cè)樣品的Ct值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品RNA濃度的log值,再推算出其濃度。

       11.     如果把本試劑盒用于定性檢測(cè),只判斷陽性或陰性,則陰性對(duì)照Ct必須大于或等于40。陽性對(duì)照必須有熒光對(duì)數(shù)增長(zhǎng),有典型擴(kuò)增曲線,Ct值應(yīng)該小于或等于30。對(duì)待測(cè)樣品,如果其Ct大于或等于40則為陰性,如果小于或等于35則為陽性。如果在35-40之間,則重復(fù)一次。重復(fù)實(shí)驗(yàn)的Ct值如果大于或等于40則為陰性,如果小于40,則為陽性。

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