蛋白質(zhì)羰基含量測定試劑盒
微量法100T/48S
注 意 :正式實(shí)驗(yàn)之前選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。
測定意義:
蛋白質(zhì)羰基是多種氨基酸在蛋白質(zhì)的氧化修飾過程中的早期標(biāo)志,其含量高低表明蛋白質(zhì)氧化損傷程度的大小,是衡量蛋白質(zhì)氧化損傷的主要指標(biāo)。
測定原理:
羰基與2,4-er硝基苯肼反應(yīng)生成紅色2,4-er硝基苯腙,在370nm處有特征吸收峰。
自備實(shí)驗(yàn)用品及儀器:
天平、恒溫水浴鍋、低溫離心機(jī)、漩渦震蕩儀、可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板、蒸餾水、無水乙醇、乙酸乙酯。
試劑組成和配制:
提取液:液體100mL×1瓶,4℃保存。
試劑一:粉劑0.1g×5支,4℃避光保存。(使用前根據(jù)樣品數(shù),每支加1mL水溶解,每支為10個樣品用量)
試劑二:液體6mL×1瓶,4℃避光保存。
試劑三:液體6mL×1瓶,4℃保存。
試劑四:液體15mL×1瓶,4℃保存。
試劑五:根據(jù)測定樣品量,將乙酸乙酯和無水乙醇等體積混合。
試劑六:液體60mL×1瓶,4℃保存。
樣品處理:
1. 組織樣品:按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL提取液)進(jìn)行冰浴勻漿,于4℃,4000g離心10min,取上清,加入0.1mL試劑一,室溫放置10min,4℃,10000g離心10min,取上清待測。
2. 細(xì)菌、真菌:按照細(xì)胞數(shù)量(104個):提取液體積(mL)為500~1000:1的比例(建議500萬細(xì)胞加入1mL提取液),冰浴超聲波破碎細(xì)胞(功率300w,超聲3秒,間隔7秒,總時間3min);然后10000g,4℃,離心10min,取上清置于冰上待測。
3. 血清等液體樣本:直接測定。
測定步驟和操作表:
1、 分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min,調(diào)節(jié)波長至370nm。
2、 操作表
對照管 | 測定管 | |
樣品(μL) | 60 | 60 |
試劑二(μL) | 120 | |
試劑三(μL) | 120 | |
混勻,37℃避光反應(yīng)1h | ||
試劑四(μL) | 150 | 150 |
靜置5min,4℃,12000g離心15min,棄上清,留沉淀 | ||
試劑五(μL) | 300 | 300 |
漩渦混勻,4℃,12000g離心10min,棄上清,留沉淀 | ||
試劑五(μL) | 300 | 300 |
漩渦混勻,4℃,12000g離心10min,棄上清,留沉淀 | ||
試劑五(μL) | 300 | 300 |
漩渦混勻,4℃,12000g離心10min,棄上清,留沉淀 | ||
試劑六(μL) | 300 | 300 |
漩渦混勻,37℃溫育15min,沉淀全部溶解后,4℃,12000g離心15min,取上清200μL于微量石英比色皿/96孔板中,測定A370。ΔA=A測定管-A對照管 |
計(jì)算公式:
a.用微量石英比色皿測定的計(jì)算公式如下
1. 按照樣本蛋白濃度計(jì)算
蛋白質(zhì)羰基含量(μmol/mg prot)= [ΔA370×V反總÷(ε×d)]÷(V樣×Cpr) =0.227×ΔA370÷Cpr
2. 按照樣本重量計(jì)算
蛋白質(zhì)羰基含量(μmol/g 鮮重)= [ΔA370×V反總÷(ε×d)]÷(W ×V樣÷V樣總) =0.227×ΔA370÷W
3. 按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算
蛋白質(zhì)羰基含量(μmol/104cell)= [ΔA370×V反總÷(ε×d)]÷(細(xì)胞數(shù)量 ×V樣÷V樣總) =0.227×ΔA370÷細(xì)胞數(shù)量
4. 按照液體體積計(jì)算
蛋白質(zhì)羰基含量(μmol/mL)= [ΔA370×V反總÷(ε×d)]÷V樣=0.227×ΔA370
V反總:反應(yīng)體系總體積,0.3 mL;ε:羰基毫摩爾消光系數(shù),22 L/mmol/cm;d:比色皿光徑,1cm;V樣:加入樣本體積,0.06 mL;V樣總:加入提取液體積,1 mL;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL,W:樣本質(zhì)量,g
b.用96孔板測定的計(jì)算公式如下
1. 按照樣本蛋白濃度計(jì)算
蛋白質(zhì)羰基含量(μmol/mg prot)= [ΔA370×V反總÷(ε×d)]÷(V樣×Cpr) =0.454×ΔA370÷Cpr
2. 按照樣本重量計(jì)算
蛋白質(zhì)羰基含量(μmol/g 鮮重)= [ΔA370×V反總÷(ε×d)]÷(W ×V樣÷V樣總) =0.454×ΔA370÷W
3. 按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算
蛋白質(zhì)羰基含量(μmol/104cell)= [ΔA370×V反總÷(ε×d)]÷(細(xì)胞數(shù)量 ×V樣÷V樣總) =0.454×ΔA370÷細(xì)胞數(shù)量
4. 按照液體體積計(jì)算
蛋白質(zhì)羰基含量(μmol/mL)= [ΔA370×V反總÷(ε×d)]÷V樣=0.454×ΔA370
V反總:反應(yīng)體系總體積,0.3 mL;ε:羰基毫摩爾消光系數(shù),22 L/mmol/cm;d:96孔板光徑,0.5cm;V樣:加入樣本體積,0.06 mL;V樣總:加入提取液體積,1 mL;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL,W:樣本質(zhì)量,g
注意事項(xiàng):
1. 試劑一使用前根據(jù)要測定的樣品數(shù)現(xiàn)配,配置好后4℃保存,若變?yōu)楹谏瑒t不能使用。
2. 試劑二見光易分解,反應(yīng)需嚴(yán)格避光。
電話
微信掃一掃