線粒體復(fù)合體Ⅲ試劑盒說明書
微量法100管/96樣
注 意 :正式測定前務(wù)必取2-3個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定
測定意義:
線粒體復(fù)合體Ⅲ(EC 1.10.2.2)又稱CoQ-細(xì)胞色素C還原酶,廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞的線粒體中,是線粒體呼吸電子傳遞鏈主路和支路的共有成分,負(fù)責(zé)把還原型CoQ的氫傳遞給細(xì)胞色素C,生成還原型細(xì)胞色素C。
測定原理:
與氧化型細(xì)胞色素C不同,還原型細(xì)胞色素C在550nm有特征光吸收,因此550nm光吸收增加速率能夠反映線粒體復(fù)合體Ⅲ酶活性。
需自備的儀器和用品:
可見分光光度計/酶標(biāo)儀、臺式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。
試劑的組成和配制:
試劑一:液體100mL×1瓶,-20℃保存;
試劑二:液體20mL×1瓶,-20℃保存;
試劑三:液體1.5mL×1支,-20℃保存;
試劑四:液體20mL×1瓶,4℃保存;
試劑五:粉劑×1支,-20℃保存;
試劑六:液體2.5mL×1瓶,-20℃保存;
樣本的前處理:
組織、細(xì)菌或細(xì)胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離:
1、 準(zhǔn)確稱取0.1g組織或收集500萬細(xì)胞,加入1mL試劑一和10uL 試劑三,用冰浴勻漿器或研缽勻漿。
2、 將勻漿600g,4℃離心5min。
3、 棄沉淀,將上清液移至另一離心管中,11000g,4℃離心10min。
4、 上清液即為除去線粒體的胞漿蛋白,可用于測定從線粒體泄漏的復(fù)合體Ⅲ(此步可選做)。
5、 步驟④中的沉淀即為線粒體,加入200uL試劑二和2uL 試劑三,超聲波破碎(冰浴,功率20%或200W,超聲3s,間隔10秒,重復(fù)30次),用于復(fù)合體Ⅲ酶活性測定。
測定步驟:
1、 分光光度計或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長至550nm,蒸餾水調(diào)零。
2、 樣本測定
(1)工作液的配制:將試劑五轉(zhuǎn)移到試劑四中混合溶解,置于37℃(哺乳動物)或25℃(其它物種)孵育5min;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復(fù)凍融。
(2)在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL樣本、25μL試劑六和200μL工作液,立即混勻,記錄
550nm處初始吸光值A1和 2min后的吸光值A2,計算ΔA=A2-A1。
復(fù)合體Ⅲ活力單位的計算:
a.使用微量石英比色皿測定的計算公式如下:
(1) 按樣本蛋白濃度計算
單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1 nmol 還原型細(xì)胞色素C定義為一個酶活力單位。
復(fù)合體Ⅲ活力(nmol/min /mg prot)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(Cpr×V樣) ÷T=615×ΔA÷Cpr
此法需要自行測定樣本蛋白質(zhì)濃度。
(2) 按樣本鮮重計算
單位的定義:每g組織每分鐘催化產(chǎn)生1nmol 還原型細(xì)胞色素C定義為一個酶活力單位。
復(fù)合體Ⅲ活力(nmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(W× V樣÷V樣總) ÷T=124×ΔA÷W
(3) 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算
單位的定義:每1萬個細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生1nmol還原型細(xì)胞色素C定義為一個酶活力單位。
復(fù)合體Ⅲ活力(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T=0.248×ΔA
V反總:反應(yīng)體系總體積,2.35×10-4 L;ε:細(xì)胞色素C摩爾消光系數(shù),1.91×104 L / mol /cm;d:比色皿光徑,1cm;V樣:加入樣本體積,0.01 mL;V樣總:加入提取液體積,0.202 mL;T:反應(yīng)時間,2 min;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL; W:樣本質(zhì)量,g;500:細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù),500萬。
b.使用96孔板測定的計算公式如下:
(1) 按樣本蛋白濃度計算
單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1 nmol 還原型細(xì)胞色素C定義為一個酶活力單位。
復(fù)合體Ⅲ活力(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=1230×ΔA÷Cpr
此法需要自行測定樣本蛋白質(zhì)濃度。
(2) 按樣本鮮重計算
單位的定義:每g組織每分鐘催化產(chǎn)生1nmol 還原型細(xì)胞色素C定義為一個酶活力單位。
復(fù)合體Ⅲ活力(nmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(W ×V樣÷V樣總) ÷T=248×ΔA÷W
(3) 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算
單位的定義:每1萬個細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生1nmol還原型細(xì)胞色素C定義為一個酶活力單位。
復(fù)合體Ⅲ活力(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T=0.496×ΔA
V反總:反應(yīng)體系總體積,2.35×10-4 L;ε:細(xì)胞色素C摩爾消光系數(shù),1.91×104 L / mol /cm;d:96孔板光徑,0.5cm;V樣:加入樣本體積,0.01 mL;V樣總:加入提取液體積,0.202 mL;T:反應(yīng)時間,2 min;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL; W:樣本質(zhì)量,g;500:細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù),500萬。
電話
微信掃一掃