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還原型抗壞血酸(ascorbic acid,AsA)含量測定試劑盒說明書

發(fā)布時間:2023/10/29      點擊次數(shù):255

還原型抗壞血酸(ascorbic acid,AsA)含量測定試劑盒說明書

                                                

微量法100T/96S

 

 

    意:正式測定之前選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。

測定意義:

AsA又稱維生素C。AsA是輔酶、自由基清除劑、電子共體/受體和草酸鹽與酒石酸鹽生物合成的底物等。作為植物細(xì)胞中最重要的抗氧化劑,AsA在保護葉綠體免于氧化損傷起著舉足輕重的作用,也是衡量農(nóng)作物產(chǎn)品品質(zhì)的重要指標(biāo)之一。

 

測定原理:

 在乙酸溶液中,抗壞血酸與固藍(lán)鹽B反應(yīng)生成黃色的草酰肼–2–羥基丁酰內(nèi)酯衍生物,在最大吸收波長420處測定吸光度。

 

自備儀器和用品:

研缽、冰、低 溫離心機、紫外分光光度計/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板、可調(diào)式移液器和蒸餾水。

 

試劑組成和配制:

提取液:液體100mL×1瓶,4℃保存。

試劑一:液體4mL×1瓶,4℃保存。

試劑二:液體6mL×1瓶,4℃保存。

試劑三:粉劑×2瓶(棕色),4℃避光保存。臨用前配制,每瓶加入7 mL蒸餾水充分溶解,用不完的試劑4℃下可保存3天。

 

樣品中AsA提取:

1.        組織:按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)15~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL提取液)進行冰浴勻漿。8000g,4℃離心20min,取上清置冰上待測。

2. 細(xì)菌、真菌:按照細(xì)胞數(shù)量(104個):提取液體積(mL)為500~10001的比例(建議500萬細(xì)胞加入1mL提取液),冰浴超聲波破碎細(xì)胞(功率300w,超聲3秒,間隔7秒,總時間3min);8000g,4℃離心20min,取上清液置冰上混勻待測。

3.  血清等液體:直接測定。

 

AsA測定操作:

1. 分光光度計/酶標(biāo)儀預(yù)熱30 min,調(diào)節(jié)波長到420 nm,蒸餾水調(diào)零。

2.EP管中加入下列試劑

試劑名稱(µL

測定管

空白管

樣本

100


提取液


100

試劑一

30

30

試劑二

50

50

試劑三

120

120

700

700

混勻,25℃靜置20min,吸取200µL加入微量石英比色皿/96孔板中,420nm下測定各管吸光值。ΔA=A測定-A空白。

注意:標(biāo)準(zhǔn)管只需測定一次。

 

AsA含量計算公式:

a.使用微量石英比色皿測定的計算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)曲線y = 0.0088x - 0.018 R2 = 0.9978

(1). 按蛋白濃度計算

AsA (μg/mg prot) =(ΔA+0.018)÷0.0088×V÷Cpr×V樣)

=113.63×(ΔA+0.018)÷Cpr

(2). 按樣本質(zhì)量計算

AsA(μg/g 鮮重) =(ΔA+0.018)÷0.0088×V÷(W×V÷V樣總)

=113.63×(ΔA+0.018)÷W

(3). 按細(xì)胞數(shù)量計算

AsA(μg/104 cell) =(ΔA+0.018)÷0.0088×V÷(細(xì)胞數(shù)量×V÷V樣總)

=113.63×(ΔA+0.018)÷細(xì)胞數(shù)量

4)按液體體積計算

AsA (μg/mL) =(ΔA+0.018)÷0.0088

=113.63×(ΔA+0.018)

V樣:加入樣品體積,0.1mL;V樣總:加入提取液體積,1.0 mL; Cpr:上清液蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣品質(zhì)量(g)。

 

b.使用96孔板測定的計算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)曲線y = 0.0044x - 0.018 ,R2 = 0.9978

(1). 按蛋白濃度計算

AsA (μg/mg prot) =(ΔA+0.018)÷0.0044×V÷Cpr×V樣)

=227.27×(ΔA+0.018)÷Cpr

(2). 按樣本質(zhì)量計算

AsA(μg/g 鮮重) =(ΔA+0.018)÷0.0044×V÷(W×V÷V樣總)

=227.27×(ΔA+0.018)÷W

(3). 按細(xì)胞數(shù)量計算

AsA(μg/104 cell) =(ΔA+0.018)÷0.0044×V÷(細(xì)胞數(shù)量×V÷V樣總)

=227.27×(ΔA+0.018)÷細(xì)胞數(shù)量

4)按液體體積計算

AsA (μg/mL) =(ΔA+0.018)÷0.0044

=227.27×(ΔA+0.018)

V樣:加入樣品體積,0.1mL;V樣總:加入提取液體積,1.0 mL; Cpr:上清液蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣品質(zhì)量(g)。

 

注意事項:

 

試劑三現(xiàn)配現(xiàn)用,配制好的4℃保存,3天內(nèi)使用完。


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