葡萄糖-6-磷酸酶(G6P)試劑盒說明書
微量法100管/96樣
注 意 :測定前務(wù)必取2-3個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定
測定意義:
葡萄糖-6-磷酸酶((glucose 6 phosphatase,G6Pase,EC 3.1.3.9)廣泛存在于動物、植物、微生物和細(xì)胞中,是糖異生過程水解葡萄糖-6-磷酸生成葡萄糖的限制酶,在保證血糖的動態(tài)平衡方面起著重要的作用。
測定原理:
G6P催化葡萄糖-6-磷酸生成葡萄糖,變旋酶和葡萄糖脫氫酶進(jìn)一步依次催化NAD+還原生成NADH,在340nm下測定NADH生成速率,即可反映G6P活性。
需自備的儀器和用品:
分光光度計/酶標(biāo)儀、臺式離心機、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。
試劑的組成和配制:
提取液:100mL×1瓶,4℃保存;
試劑一:液體19 mL×1瓶, 4℃保存;
試劑二:粉劑×1支,-20℃保存;
試劑三:粉劑×1支,-20℃保存;
試劑四:試劑×1支,-20℃保存;
樣本的前處理:
1、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞:先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi),離心后棄上清;按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量(104個):提取液體積(mL)為500~1000:1的比例(建議500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液),超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞(冰浴,功率20%或200W,超聲3s,間隔10s,重復(fù)30次);8000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測。
2、組織:按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL提取液),進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測。
3、血清(漿)樣品:直接檢測。
測定步驟:
1、 分光光度計或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長至340nm,蒸餾水調(diào)零。
工作液的配制:臨用前將試劑二、試劑三和試劑四轉(zhuǎn)移到試劑一中混合溶解待用;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復(fù)凍融。
2、 將工作液置于37℃(哺乳動物)或25℃(其它物種)預(yù)熱5分鐘。
3、 在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL樣本和190μL工作液,立即混勻,記錄340nm處初始吸光值A1和 2min后的吸光值A2,計算ΔA=A2-A1。
注意:在該試劑盒中,若ΔA大于0.3,需將樣本用提取液稀釋適當(dāng)倍數(shù)后測定,使ΔA小于0.3可提高檢測靈敏度。計算公式中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)。
G6P活性計算:
a.用微量石英比色皿測定的計算公式如下
1、血清(漿)G6P活力計算
單位定義:每毫升血清(漿)每分鐘生成1 nmol NADH定義為一個酶活力單位。
G6P(nmol/min/mL))=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷V樣÷T=1608×ΔA
2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中G6P活力計算
(1)按樣本蛋白濃度計算
單位定義:每mg組織蛋白每分鐘生成1nmol NADH定義為一個酶活力單位。
G6P(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=1608×ΔA÷Cpr
(2)按樣本鮮重計算
單位定義:每g組織每分鐘生成1 nmol NADH定義為一個酶活力單位。
G6P(nmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(W ×V樣÷V樣總)÷T=1608×ΔA÷W
(3)按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算:
單位定義:每1萬個細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘生成1 nmol NADH定義為一個酶活力單位。
G6P(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(500×V樣÷V樣總)÷T=3.215×ΔA
V反總:反應(yīng)體系總體積,1×10-3 L;ε:NADH摩爾消光系數(shù),6.22×103 L / mol /cm;d:比色皿光徑,1cm;V樣:加入樣本體積,0.05 mL;V樣總:加入提取液體積,1 mL;T:反應(yīng)時間,2 min;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g;500:細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù),500萬。
b.用96孔板測定的計算公式如下
1、血清(漿)G6P活力計算
單位定義:每毫升血清(漿)每分鐘生成1 nmol NADH定義為一個酶活力單位。
G6P(nmol/min/mL))=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷V樣÷T=3216×ΔA
2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中G6P活力計算
(1)按樣本蛋白濃度計算
單位定義:每mg組織蛋白每分鐘生成1nmol NADH定義為一個酶活力單位。
G6P(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=3216×ΔA÷Cpr
(2)按樣本鮮重計算
單位定義:每g組織每分鐘生成1 nmol NADH定義為一個酶活力單位。
G6P(nmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(W ×V樣÷V樣總)÷T=3216×ΔA÷W
(3)按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算:
單位定義:每1萬個細(xì)胞或細(xì)胞每分鐘生成1 nmol NADH定義為一個酶活力單位。
G6P(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(500×V樣÷V樣總)÷T=6.43×ΔA
V反總:反應(yīng)體系總體積,2×10-4 L;ε:NADH摩爾消光系數(shù),6.22×103 L / mol /cm;d:96孔板光徑,0.5cm;V樣:加入樣本體積,0.01 mL;V樣總:加入提取液體積,1 mL;T:反應(yīng)時間,2 min;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g;500:細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù),500萬。
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