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3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)試劑盒說明書

發(fā)布時(shí)間:2023/10/24      點(diǎn)擊次數(shù):269

3-磷酸甘油醛脫氫酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)試劑盒說明書

                                       微量法100/96

 

    意:正式測定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定

測定意義

GAPDH催化3-磷酸甘油醛氧化生成1,3-二磷酸甘油酸,是糖酵解途徑的關(guān)鍵酶,與糖異生途徑、體內(nèi)血糖濃度的維持和糖尿病的發(fā)生密切相關(guān),在機(jī)體糖、脂、蛋白代謝紊亂疾病中發(fā)揮重要作用。

 

測定原理

3-磷酸甘油酸激酶催化三磷酸甘油酸和ATP生成1,3二磷酸甘油酸。GAPDH逆向催化1,3二磷酸甘油酸和NADH生成3磷酸甘油醛、無機(jī)磷和NAD,340nm處測定NADH的減少量可反映GADPH活性的高低。

需自備的儀器和用品

分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、恒溫水浴鍋、臺式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。

 

試劑的組成和配制

提取液一:液體100mL×1瓶,4℃保存。

提取液二:液體100mL×1瓶,4℃保存。

試劑一:粉劑×1瓶,-20保存;

試劑二:液體20mL×1瓶,4保存;

試劑三:液體14uL×1支,4保存;

 

組織樣本的前處理

GAPDH酶提取:建議稱取約0.1g樣本,加入1mL提取液一,冰浴勻漿后超聲破碎(冰浴,200W,破碎3s,間歇7s,總時(shí)間1min),然后48000g離心10min,取上清測定。

②胞漿和葉綠體GAPDH酶的分離:按照植物組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)1510的比例(建議稱取約0.1g樣本,加入1mL提取液一),冰浴勻漿后于4,200g離心5min,棄沉淀,取上清在4,8000g離心10min,取上清用于測定胞漿GAPDH酶活性,取沉淀加1mL提取液二,震蕩溶解后超聲破碎(冰浴,200W,破碎3s,間歇7s,總時(shí)間1min),然后4,8000g離心10min,取上清測定葉綠體中GAPDH酶活性。

建議測定總GAPDH酶活性,按照步驟①提取粗酶液,若需要分別測定胞漿和葉綠體中的GAPDH,則按照

步驟②提取粗酶液。

 

細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞的前處理

先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi),離心后棄上清;按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量(104個(gè)):提取液一體積(mL)為500~10001的比例(建議500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液一),超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞(冰浴,功率20%或200W,超聲3s,間隔10s,重復(fù)30次);8000g 4離心10min,取上清,置冰上待測。

 

 

測定步驟

1、  分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長至340nm,蒸餾水調(diào)零。

2、  樣本測定

1工作液的配制:將試劑二全部倒入試劑一瓶中,充分溶解,37℃(哺乳動(dòng)物)25(其它物種)預(yù)熱10分鐘;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復(fù)凍融。

2)在試劑三中加入500μL蒸餾水,充分混勻待用;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復(fù)凍融

3)在微量石英比色皿或96孔板中加入5μL樣本、5μL試劑三和190μL工作液,混勻,加入最后一個(gè)試劑的同時(shí)開始計(jì)時(shí),記錄340nm20s時(shí)的吸光值A1 5min20s后的吸光值A2,計(jì)算ΔA=A1-A2

 

GAPDH活性計(jì)算

a.用微量石英比色皿測定的計(jì)算公式如下

1)按樣本蛋白濃度計(jì)算

單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘消耗1 nmolNADH定義為一個(gè)酶活力單位。

GAPDHnmol/min/mg prot)=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷(V×Cpr) ÷T=1286×ΔA÷Cpr

2)按樣本鮮重計(jì)算

單位的定義:每g組織每分鐘消耗1 nmolNADH定義為一個(gè)酶活力單位。

GAPDHnmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷(W ×V÷V樣總) ÷T=1286×ΔA÷W

3)按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

單位的定義:每一萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘消耗1 nmolNADH定義為一個(gè)酶活力單位。

GAPDHnmol/min/104 cell)=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷(500 ×V÷V樣總) ÷T=2.572×ΔA

V反總:反應(yīng)體系總體積,2×10-4 LεNADH摩爾消光系數(shù),6.22×103 L / mol /cm;d:比色皿光徑,1cmV樣:加入樣本體積,0.005 mL;V樣總:加入提取液體積,1 mL;T:反應(yīng)時(shí)間,5 min;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g;500:細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù),500萬。

 

b.96孔板測定的計(jì)算公式如下

1)按樣本蛋白濃度計(jì)算

單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘消耗1 nmolNADH定義為一個(gè)酶活力單位。

GAPDHnmol/min/mg prot)=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷(V×Cpr) ÷T=2572×ΔA÷Cpr

2)按樣本鮮重計(jì)算

單位的定義:每g組織每分鐘消耗1 nmolNADH定義為一個(gè)酶活力單位。

GAPDHnmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷(W ×V÷V樣總) ÷T=2572×ΔA÷W

3)按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

單位的定義:每一萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘消耗1 nmolNADH定義為一個(gè)酶活力單位。

GAPDHnmol/min/104 cell)=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷(500 ×V÷V樣總) ÷T=5.144×ΔA

V反總:反應(yīng)體系總體積,2×10-4 L;εNADH摩爾消光系數(shù),6.22×103 L / mol /cmd96孔板光徑,0.5cm;V樣:加入樣本體積,0.005 mL;V樣總:加入提取液體積,1 mLT:反應(yīng)時(shí)間,5 minCpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mLW:樣本質(zhì)量,g;500:細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù),500萬。


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