錳過(guò)氧化物酶(Manganese peroxidase,Mnp)試劑盒說(shuō)明書(shū)
微量法100T/96S
注 意 :正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。
測(cè)定意義:
錳過(guò)氧化物酶(EC1.11.1.13)是一種含亞鐵血紅素的過(guò)氧化物酶,主要存在于擔(dān)子菌中,屬于木質(zhì)素降解酶系,能有效的降解木質(zhì)素及廢水和土壤中比較難降解的氯化物,疊氮化合物、DTT,多環(huán)芳烴等。
測(cè)定原理:
錳過(guò)氧化物酶在Mn2+存在的條件下,將愈創(chuàng)木酚氧化為四鄰甲氧基連酚,在465nm有特征吸收峰。
自備實(shí)驗(yàn)用品及儀器:
天平、研缽、低溫離心機(jī)、可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板、恒溫水浴鍋。
試劑組成和配制:
試劑一:液體110mL×1瓶,4℃保存。
試劑二:液體2mL×1支,4℃保存。
試劑三:液體5mL×1瓶,4℃避光保存。
試劑四:液體2mL×1支,4℃保存。
酶液提?。?/p>
1. 組織:按照質(zhì)量(g):試劑一體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g,加入1mL試劑一)加入試劑一,冰浴勻漿后于4℃,10000g離心10min,取上清置于冰上待測(cè)。
2. 細(xì)胞:按照細(xì)胞數(shù)量(104個(gè)):試劑一體積(mL)為500~1000:1的比例(建議500萬(wàn)細(xì)胞加入1mL試劑一),冰浴超聲波破碎細(xì)胞(功率300w,超聲3秒,間隔7秒,總時(shí)間3min);然后4℃,10000g離心10min,取上清置于冰上待測(cè)。
3. 培養(yǎng)液或其它液體:直接檢測(cè)。
測(cè)定操作:
1、 分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至465nm,蒸餾水調(diào)零。
2、 測(cè)定前將試劑一、二、三、四在37℃(哺乳動(dòng)物)或25℃(其它物種)放置10min以上。
3、 樣本測(cè)定表
試劑名稱(µL) | 測(cè)定管 |
樣本 | 20 |
試劑一 | 100 |
試劑二 | 20 |
試劑三 | 40 |
試劑四 | 20 |
在微量石英比色皿或96孔板中按順序加入上述試劑,立即混勻并計(jì)時(shí),記錄465nm下30s時(shí)的吸光值A(chǔ)1和2min30s后的吸光值A(chǔ)2。計(jì)算ΔA=A2-A1。
注意:若一次性測(cè)定樣本較多,可將試劑一、二、三、四按比例配成混合液,在37℃(哺乳動(dòng)物)或25℃(其它物種)放置10min以上,測(cè)定時(shí)加入20µL樣本和180µL混合液測(cè)定。
酶活計(jì)算公式:
a. 用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下
1.按照蛋白濃度計(jì)算
酶活性定義:每毫克蛋白每分鐘氧化1nmol愈創(chuàng)木酚所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。
MnP活性(nmol/min/mg prot)= [ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=413×ΔA÷Cpr
2.按照樣本質(zhì)量計(jì)算
酶活性定義:每克樣品每分鐘氧化1nmol愈創(chuàng)木酚所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。
MnP活性(nmol/min/g 鮮重)= [ΔA×V反總÷(ε×d)×109] ÷(V樣×W÷V樣總)÷T= 413×ΔA÷W
3.按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算
酶活性定義:每104個(gè)細(xì)胞每分鐘氧化1nmol愈創(chuàng)木酚所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。
MnP活性(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109] ÷(V樣×細(xì)胞數(shù)量÷V樣總)÷T
= 413×ΔA÷細(xì)胞數(shù)量
4.按照液體體積計(jì)算
酶活性定義:每毫升培養(yǎng)液每分鐘氧化1nmol愈創(chuàng)木酚所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。
MnP活性(nmol/min/mL)= [ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷V樣÷T= 413×ΔA
ε:愈創(chuàng)木酚摩爾消光系數(shù):12100L/mol/cm;d:比色皿光徑,1cm;V反總:反應(yīng)總體積,2×10-4 L;V樣:反應(yīng)中樣本體積,0.02mL;V樣總:加入提取液體積,1mL;Cpr:樣本蛋白濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g;T:反應(yīng)時(shí)間,2min
b. 用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下
1.按照蛋白濃度計(jì)算
酶活性定義:每毫克蛋白每分鐘氧化1nmol愈創(chuàng)木酚所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。
MnP活性(nmol/min/mg prot)= [ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=826×ΔA÷Cpr
2.按照樣本質(zhì)量計(jì)算
酶活性定義:每克樣品每分鐘氧化1nmol愈創(chuàng)木酚所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。
MnP活性(nmol/min/g 鮮重)= [ΔA×V反總÷(ε×d)×109] ÷(V樣×W÷V樣總)÷T= 826×ΔA÷W
3.按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算
酶活性定義:每104個(gè)細(xì)胞每分鐘氧化1nmol愈創(chuàng)木酚所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。
MnP活性(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109] ÷(V樣×細(xì)胞數(shù)量÷V樣總)÷T
= 826×ΔA÷細(xì)胞數(shù)量
4.按照液體體積計(jì)算
酶活性定義:每毫升培養(yǎng)液每分鐘氧化1nmol愈創(chuàng)木酚所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。
MnP活性(nmol/min/mL)= [ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷V樣÷T= 826×ΔA
ε:愈創(chuàng)木酚摩爾消光系數(shù):12100L/mol/cm;d:96孔板光徑,0.5cm;V反總:反應(yīng)總體積,2×10-4 L;V樣:反應(yīng)中樣本體積,0.02mL;V樣總:加入提取液體積,1mL;Cpr:樣本蛋白濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g;T:反應(yīng)時(shí)間,2min
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