高鐵還原酶（ferric-chelate reductase, FCR）試劑盒說(shuō)明書(shū)

                                        微量法100管/96樣

注    意： 正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義：

高鐵還原酶（ferric-chelate reductase, FCR）催化高價(jià)鐵螯合物中的Fe3+還原為Fe2+，在部分物種鐵元素的吸收中有重要作用。

測(cè)定原理：

FCR催化Fe³⁺還原為Fe²⁺，Fe²⁺和ferrozine反應(yīng)顯色，在562nm下有特征吸光值。

自備用品：

可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。

試劑組成和配制：

試劑一：液體6mL×1瓶，4℃避光保存;

試劑二：液體6mL×1瓶，4℃避光保存;

試劑三：液體6mL×1瓶，4℃保存。

粗酶液提取：

按照組織質(zhì)量（g）：水（mL)為1：5~10的比例（建議稱(chēng)取約0.1g組織，加入1mL蒸餾水），進(jìn)行冰浴勻漿。10000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。

測(cè)定步驟：

1、   分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至562nm，蒸餾水調(diào)零。

2、   工作液配制：將試劑一、二、三以1:1:1的比例混合。臨用前配制，用多少配多少。

3、   在微量石英比色皿/96孔板中，加入50μL樣本上清和150μL工作液，混勻，記錄初始吸光值A1和30min后的吸光值A2。ΔA=A2-A1。

FCR活性計(jì)算:

a.用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)曲線：y = 8.0014x + 0.0011，R² = 0.9997；

（1）按樣本質(zhì)量計(jì)算

單位定義：每g樣本每分鐘產(chǎn)生1nmolFe²⁺-ferrozine定義為一個(gè)酶活力單位。

FCR（nmol/min/g 鮮重）=（△A-0.0011）÷ 8.0014×1000×V標(biāo)÷(V樣÷V樣總×W)÷T

                       = 4.166×（△A-0.0011）÷W

（2）按樣本蛋白濃度計(jì)算

單位定義：每mg蛋白每分鐘產(chǎn)生1nmolFe²⁺-ferrozine定義為一個(gè)酶活力單位。

FCR（nmol/min/mg prot）=（△A-0.0011）÷8.0014×1000×V標(biāo)÷(V樣÷V樣總×Cpr)÷T

                =4.166×（△A-0.0011）÷Cpr

V樣總：加入提取液體積，1 mL；V樣：反應(yīng)中樣品體積，50μL；V標(biāo)：加入標(biāo)準(zhǔn)品體積 ，50μL；T：反應(yīng)時(shí)間，30min；W：樣品質(zhì)量，g；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；1000，μmol到nmol的轉(zhuǎn)換系數(shù)。

b.用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)曲線：y = 4.0007x + 0.0011，R² = 0.9997；y，吸光度

（1）按樣本質(zhì)量計(jì)算

單位定義：每g樣本每分鐘產(chǎn)生1nmolFe²⁺-ferrozine定義為一個(gè)酶活力單位。

FCR（nmol/min/g 鮮重）=（△A-0.0011）÷4.0007×1000×V標(biāo)÷(V樣÷V樣總×W)÷T

                        =8.331×（△A-0.0011）÷W

（2）按樣本蛋白濃度計(jì)算

單位定義：每mg蛋白每分鐘產(chǎn)生1nmolFe²⁺-ferrozine定義為一個(gè)酶活力單位。

FCR（nmol/min/mg prot）=（△A-0.0011）÷4.0007×1000×V標(biāo)÷(V樣÷V樣總×W)÷T

                        =8.331×（△A-0.0011）÷Cpr

V樣總：加入提取液體積，1 mL；V樣：反應(yīng)中樣品體積，50μL；V標(biāo)：加入標(biāo)準(zhǔn)品體積 ，50μL；T：反應(yīng)時(shí)間，30min；W：樣品質(zhì)量，g；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；1000，μmol到nmol的轉(zhuǎn)換系數(shù)。