氧化型谷胱甘肽含量測(cè)定試劑盒說(shuō)明書
微量法100T/96S
注 意:正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。
測(cè)定意義:
GSH/GSSG是細(xì)胞內(nèi)最重要的氧化還原對(duì)之一。因此,測(cè)定細(xì)胞內(nèi)GSH和GSSG含量以及GSH/GSSG比值,能夠很好地反映細(xì)胞所處的氧化還原狀態(tài),也是谷胱甘肽氧化還原循環(huán)的主要指標(biāo)之一。
測(cè)定原理:
利用2-VP法測(cè)GSSG含量。
自備儀器和用品:
低溫離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)節(jié)移液器、可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量玻璃比色皿/96孔板、和蒸餾水。
試劑組成和配置:
試劑一:液體100mL×1瓶,4℃保存。
試劑二:液體600μL×1支,4℃保存。
試劑三:液體50mL×1瓶,4℃保存。
試劑四:液體2.5mL×1瓶,4℃保存。
試劑五: 液體15μL×1瓶,-20℃保存。臨用前加入0.3mL試劑三稀釋,4℃保存。
試劑六:粉劑×1瓶,4℃保存。臨用前加入20 mL試劑三溶解,現(xiàn)配現(xiàn)用。
粗酶液提?。?/span>
1. 組織:按照組織質(zhì)量(g):試劑一體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL試劑一)進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min,取上清液(如上清不清澈,再離心3min)待測(cè)。
2. 細(xì)菌、真菌:按照細(xì)胞數(shù)量(104個(gè)):試劑一體積(mL)為500~1000:1的比例(建議500萬(wàn)細(xì)胞加入1mL試劑一),冰浴超聲波破碎細(xì)胞(功率300w,超聲3秒,間隔7秒,總時(shí)間3min);8000g 4℃離心10min,取上清液(如上清不清澈,再離心3min)混勻待測(cè)。
3. 血清等液體:直接測(cè)定。
GSSG含量測(cè)定:
1. 分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到412nm,蒸餾水調(diào)零。
2. 試劑三置于25℃(一般物種)或者37℃(哺乳動(dòng)物)水浴中保溫30min。
3.取1 mL EP管,加入100μ L上清液,5 μ L試劑二,蓋緊后混勻,得混合液,置于37℃水浴30min;取21μ L混合液于96孔板,然后依次加入20 μ L試劑四、2 μ L試劑五和140 μ L試劑六,迅速混勻后,測(cè)定30 s和150 s光吸收A1和A2,計(jì)算ΔA=A2-A1。
GSSG含量計(jì)算公式:
a.使用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下
1、標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定的回歸方程為y=0.0276x-0.0011;x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度(nmol/mL),y為吸光值(ΔA)。
2、 按蛋白濃度計(jì)算
GSSG(nmol/mg prot)=(ΔA+0.0011)÷0.0276×V樣÷(V樣×Cpr)
=36.23×(ΔA+0.0011)÷Cpr
3、按樣本鮮重計(jì)算
GSSG(nmol /g 鮮重)=(ΔA+0.0011)÷0.0276×V樣÷(V樣÷V樣總×W)
=36.23×(ΔA+0.0011)÷W
4、按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算
GSSG(nmol/104 cell)=(ΔA+0.0011)÷0.0276×V樣÷(V樣÷V樣總×細(xì)胞數(shù)量)
=36.23×(ΔA+0.0011)÷細(xì)胞數(shù)量
5、按照液體體積計(jì)算
GSSG(nmol/mL)=(ΔA+0.0011)÷0.0276×V樣÷V樣
=36.23×(ΔA+0.0011)
V樣:反應(yīng)中加入樣本體積,20μL;V樣總:加入提取液體積, 1mL;W:樣品質(zhì)量,g,Cpr:樣本蛋白濃度(mg/mL)
b.使用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下
1、標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定的回歸方程為y=0.0138x-0.0011;x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度(nmol/mL),y為吸光值(ΔA)。
2、 按蛋白濃度計(jì)算
GSSG(nmol/mg prot)=(ΔA+0.0011)÷0.0138×V樣÷(V樣×Cpr)
=72.46×(ΔA+0.0011)÷Cpr
3、按樣本鮮重計(jì)算
GSSG(nmol /g 鮮重)=(ΔA+0.0011)÷0.0138×V樣÷(V樣÷V樣總×W)
=72.46×(ΔA+0.0011)÷W
4、按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算
GSSG(nmol/104 cell)=(ΔA+0.0011)÷0.0138×V樣÷(V樣÷V樣總×細(xì)胞數(shù)量)
=72.46×(ΔA+0.0011)÷細(xì)胞數(shù)量
5、按照液體體積計(jì)算
GSSG(nmol/mL)=(ΔA+0.0011)÷0.0138×V樣÷V樣
=72.46×(ΔA+0.0011)
V樣:反應(yīng)中加入樣本體積,20μL;V樣總:加入提取液體積, 1mL;W:樣品質(zhì)量,g,Cpr:樣本蛋白濃度(mg/mL)
注意事項(xiàng):
1. 提取過(guò)程中去掉蛋白質(zhì),所以提取液不能用于測(cè)定蛋白含量。
2. 臨用前配制的試劑配好后4℃保存,2天內(nèi)使用完畢。
3. Z低檢出限為0.1μmol/L。
4. 反應(yīng)溫度嚴(yán)格來(lái)說(shuō),為保證重復(fù)性,應(yīng)在25℃下進(jìn)行反應(yīng)。
5. 反應(yīng)時(shí)間需精確控制,否則會(huì)影響反應(yīng)速率計(jì)算,產(chǎn)生較大誤差。
6. 樣品中的GSSG濃度盡可能低一些,否則反應(yīng)速率太大,沒法控制,所以稀釋倍數(shù)要盡量大些。
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