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土壤亮氨酸氨基肽酶(Solid-Leucine Aminopeptidase,S- LAP)試劑盒說(shuō)明書(shū)

發(fā)布時(shí)間:2023/9/25      點(diǎn)擊次數(shù):262

土壤亮氨酸氨基肽酶(Solid-Leucine Aminopeptidase,S- LAP)試劑盒說(shuō)明書(shū)

                                  微量法100管/48樣

 

注   意 :正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義:                           

S-LAP是一類能水解肽鏈N-末端為亮氨酸的酶,由土壤微生物分泌。S-LAP活性變化與機(jī)體某些病理狀態(tài)密切相關(guān)。

 

測(cè)定原理:

S-LAP分解L-亮氨酰對(duì)硝基苯胺生成對(duì)硝基苯胺,后者在405nm有最大吸收峰,通過(guò)測(cè)定吸光值升高速率來(lái)計(jì)算S-LAP活性。

 

自備用品:

酶標(biāo)儀/可見(jiàn)分光光度計(jì)、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、96孔板/微量石英比色皿和蒸餾水。

 

試劑的組成和配制:

試劑一:液體35mL×1瓶,4℃保存;

試劑二:粉劑×1瓶,-20℃保存;

 

S-LAP測(cè)定步驟:

1、   分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至405nm,蒸餾水調(diào)零。

2、   在試劑二瓶中加入15mL試劑一充分溶解(如較難溶解,可60℃水浴加熱約30min促進(jìn)溶解);用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復(fù)凍融。

3、   操作表

試劑名稱

對(duì)照管

測(cè)定管

新鮮土樣(g)

0.05

0.05

試劑一(μL)

300


試劑二(μL)


300

混勻, 37℃振蕩反應(yīng)1h后,8000g 4℃離心10min,S-LAP活力單位的計(jì)算:

取200μL上清液于微量石英比色皿或96孔板中,405nm處測(cè)定吸光值A(chǔ),計(jì)算ΔA=A測(cè)定管-A對(duì)照管。每個(gè)測(cè)定管設(shè)一個(gè)對(duì)照管。

 

a.用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下:

單位的定義:每天每g土樣每天生成1 μmol 對(duì)硝基苯胺定義為一個(gè)酶活力單位。

S-LAP(μmol/d /g 土樣)=ΔA×V反總÷(ε×d)×106÷W÷T=14.8×ΔA

V反總:反應(yīng)體系總體積,3×10-4 L;ε:對(duì)硝基苯胺摩爾消光系數(shù),9.72×103 L / mol /cm;d:比色皿光徑,

 

1cm;T:反應(yīng)時(shí)間,1h=1/24d; W:樣本質(zhì)量,0.05g。

 

b.用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下:

單位的定義:每天每g土樣每天生成1 μmol 對(duì)硝基苯胺定義為一個(gè)酶活力單位。

S-LAP(μmol/d /g 土樣)=ΔA×V反總÷(ε×d)×106÷W÷T=29.6×ΔA

V反總:反應(yīng)體系總體積,3×10-4 L;ε:對(duì)硝基苯胺摩爾消光系數(shù),9.72×103 L / mol /cm;d:比色皿光徑,0.5cm;T:反應(yīng)時(shí)間,1h=1/24d; W:樣本質(zhì)量,0.05g。


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