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土壤幾丁質(zhì)酶(Soil Chitinase,S-Chitinase)試劑盒說明書

發(fā)布時(shí)間:2023/9/22      點(diǎn)擊次數(shù):249

土壤幾丁質(zhì)酶(Soil Chitinase,S-Chitinase)試劑盒說明書

                                                 微量法100T/48S

 

 

注   意 :正式測定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。

測定意義:

幾丁質(zhì)主要存在于蝦、蟹、昆蟲等甲殼類動(dòng)物的外殼與軟體動(dòng)物的器官(例如烏賊的軟骨),以及真菌類的細(xì)胞壁中,而幾丁質(zhì)酶(EC 3.2.1.14)可催化幾丁質(zhì)水解,具有抵御真菌侵染的作用,成為抗真菌病害的研究熱點(diǎn)。

 

測定原理:

幾丁質(zhì)酶水解幾丁質(zhì)產(chǎn)生N-乙酰氨基葡萄糖,進(jìn)一步與對二甲氨基苯甲醛產(chǎn)生紅色化合物,在585nm處有特征吸收峰,吸光值增加速率反映了幾丁質(zhì)酶的活性。

 

自備實(shí)驗(yàn)用品及儀器:

天平、水浴鍋、離心機(jī)、震蕩儀、可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板,甲苯、蒸餾水。

 

試劑組成和配制:

試劑一:液體10mL×1瓶,4℃保存。

試劑二:液體4mL×1瓶,4℃保存。

試劑三:液體65mL×1瓶,4℃避光保存。

 

樣品處理:

新鮮土樣風(fēng)干,過30-50目篩。

 

測定操作表:

 


對照管

測定管

土樣(g)

0.1

0.1

甲苯(μL)

15

15

混勻,25℃靜置15min

蒸餾水(μL)

100


試劑一(μL)


100

混勻,37℃培養(yǎng)24h

蒸餾水(μL)

200

200

4000rpm,4℃,離心10min,取上清200μL于新的EP管中

試劑二(μL)

20

20

混勻,沸水浴5min

試劑三(μL)

600

600

混勻,37℃顯色20min,取200μL于微量石英比色皿/96孔板中,蒸餾水調(diào)零,測定585nm處吸光值,記為A對照管和A測定管,ΔA=A測定管-A對照管。

 

計(jì)算公式:

a.        用微量石英比色皿測定的計(jì)算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)曲線:y=5.2714x-0.0007,R2=0.9989;x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度(mg/mL),y為吸光值ΔA。

酶活性定義:37℃條件下,每克土壤每天分解幾丁質(zhì)產(chǎn)生1μg N-乙酰氨基葡萄糖的酶量為一個(gè)酶活性單位。

土壤幾丁質(zhì)酶活性(μg/d/g 土樣)=(ΔA +0.0007)÷5.2714×V反總÷W÷T×1000

= 598×(ΔA +0.0007)

V反總:反應(yīng)體系總體積,0.315mL;W:樣本質(zhì)量,0.1g;T:反應(yīng)時(shí)間,1d;1000:1mg/mL=1000μg/mL

 

b.       用96孔板測定的計(jì)算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)曲線:y=2.6357x-0.0007,R2=0.9989;x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度(μg/mL),y為吸光值ΔA。

酶活性定義:37℃條件下,每克土壤每天分解幾丁質(zhì)產(chǎn)生1μg N-乙酰氨基葡萄糖的酶量為一個(gè)酶活性單位。

土壤幾丁質(zhì)酶活性(μg/d/g 土樣)=(ΔA +0.0007)÷2.6357×V反總÷W÷T×1000

= 1195×(ΔA +0.0007)

V反總:反應(yīng)體系總體積,0.315mL;W:樣本質(zhì)量,0.1g;T:反應(yīng)時(shí)間,1d;1000:1mg/mL=1000μg/mL

 

注意事項(xiàng):

試劑一充分混勻后再使用。


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