乙醇酸氧化酶(glycollic oxidase, GO)試劑盒說明書
微量法100T/96S
注 意:正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定。
測定意義:
乙醇酸氧化酶(EC1.1.3.1)是植物光呼吸代謝中的關(guān)鍵酶,也是光下合成草酸的關(guān)鍵酶,它催化乙醇酸氧化生成乙醛酸,對研究光呼吸代謝過程及其調(diào)控具有重要意義。
測定原理:
乙醇酸氧化酶催化乙醇酸氧化生成乙醛酸,乙醛酸和鹽酸苯肼反應(yīng)生成乙醛酸苯腙,在324nm有特征吸收峰。
自備實驗用品及儀器:
天平、低溫離心機、紫外分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96孔板(UV板)。
試劑組成和配制:
提取液:液體100mL×1瓶,4℃保存。
試劑一:液體15mL×1瓶,4℃保存。
試劑二:粉劑×1瓶,4℃避光保存,臨用前加5mL雙蒸水溶解;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復凍融。
試劑三:液體2mL×1支,4℃保存。
酶液提?。?/p>
按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL提取液),進行冰浴勻漿。12000g, 4℃離心10min,取上清,置冰上待測。
測定操作表:
測定管 | |
樣本(μL) | 10 |
試劑一(μL) | 130 |
試劑二(μL) | 40 |
試劑三(μL) | 20 |
充分混勻,立即于微量石英比色皿/96孔板中測定324nm處10s和190s吸光值A(chǔ)1和A2,△A=A2- A1 |
酶活性計算公式:
a.用微量石英比色皿測定的計算公式如下
1.按照蛋白濃度計算
酶活性定義:每毫克蛋白每分鐘氧化1nmol乙醇酸所需的酶量為一個酶活力單位。
GO活性(nmol/min /mg prot)= ×V反總÷(V樣×Cpr)÷T= 392×△A÷Cpr
2.按照樣本質(zhì)量計算
酶活性定義:每克組織每分鐘氧化1 nmol乙醇酸所需的酶量為一個酶活力單位。
GO活性(nmol/min /g 鮮重)= ×V反總÷(V樣×W÷V樣總)÷T= 392×△A÷W
ε:乙醛酸苯腙毫摩爾消光系數(shù):17L/mmol/cm;d:比色皿光徑,1cm;V反總:反應(yīng)總體積,0.2mL;V樣:反應(yīng)中樣本體積,0.01mL;V樣總:加入提取液體積,1mL;Cpr:樣本蛋白濃度,mg/mL;W,樣本質(zhì)量,g;T:反應(yīng)時間,3min
b. 用96孔板測定的計算公式如下
1.按照蛋白濃度計算
酶活性定義:每毫克蛋白每分鐘氧化1nmol乙醇酸所需的酶量為一個酶活力單位。
GO活性(nmol/min /mg prot)= ×V反總÷(V樣×Cpr)÷T= 784×△A÷Cpr
2.按照樣本質(zhì)量計算
酶活性定義:每克組織每分鐘氧化1nmol乙醇酸所需的酶量為一個酶活力單位。
GO活性(nmol/min /g 鮮重)= ×V反總÷(V樣×W÷V樣總)÷T= 784×△A÷W
ε:乙醛酸苯腙毫摩爾消光系數(shù):17L/mmol/cm;d:比色皿光徑,0.5cm;V反總:反應(yīng)總體積,0.2mL;V樣:反應(yīng)中樣本體積,0.01mL;V樣總:加入提取液體積,1mL;Cpr:樣本蛋白濃度,mg/mL;W,樣本質(zhì)量,g;T:反應(yīng)時間,3min
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