丙酮酸磷酸雙激酶(PPDK)試劑盒說(shuō)明書
微量法100管/96樣
注 意:正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定
測(cè)定意義:
丙酮酸磷酸雙激酶(pyruvate phosphate dikinase, PPDK, EC 2.7.9.1)是C4途徑和景天科酸代謝途徑的限速酶,催化ATP、丙酮酸和Pi經(jīng)三步反應(yīng)生成磷酸烯醇式丙酮酸。該酶主要存在于C4植物的葉綠體基質(zhì)中,對(duì)光合功能具有重要調(diào)節(jié)作用。
測(cè)定原理:
PPDK的逆向反應(yīng)催化磷酸烯醇式丙酮酸、AMP和PPi生成丙酮酸、ATP和Pi,乳酸脫氫酶進(jìn)一步催化丙酮酸和NADH生成乳酸和NAD+,在340nm測(cè)定NADH減少速率,計(jì)算PPDK活性。
需自備的儀器和用品:
紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。
試劑的組成和配制:
提取液:100mL×1瓶,4℃保存;
試劑一:液體25 mL×1瓶, 4℃保存;
試劑二:粉劑×2瓶,-20℃保存;
試劑三 :液體40μL×1支,4℃保存;體積較少,若沾在管壁上,臨用前可低速離心后使用。
樣本的前處理:
按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL提取液),進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測(cè)。
測(cè)定步驟和加樣表:
1、 分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至340nm,蒸餾水調(diào)零。
2、 樣本測(cè)定
(1)工作液的配制:臨用前取試劑二一瓶加入10mL試劑一和5μL試劑三,充分混勻,置于37℃水浴5min;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復(fù)凍融。
(2)在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL樣本和190μL工作液,混勻,立即記錄340nm處初始吸光值A1和37℃反應(yīng)5min后的吸光值A2,計(jì)算ΔA=A1-A2。
PPDK活性計(jì)算:
a.用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下
(1)按樣本蛋白濃度計(jì)算
單位定義:每mg組織蛋白每分鐘消耗1nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。
PPDK(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=643×ΔA÷Cpr
(2)按樣本鮮重計(jì)算
單位定義:每g組織每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。
PPDK(nmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(W ×V樣÷V樣總)÷T=643×ΔA÷W
V反總:反應(yīng)體系總體積,2×10-4 L;ε:NADH摩爾消光系數(shù),6.22×103 L / mol /cm;d:比色皿光徑,1cm;V樣:加入樣本體積,0.01 mL;V樣總:加入提取液體積,1 mL;T:反應(yīng)時(shí)間,5 min;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g;500:細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù),500萬(wàn)。
b.用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下
(1)按樣本蛋白濃度計(jì)算
單位定義:每mg組織蛋白每分鐘消耗1nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。
PPDK(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=1286×ΔA÷Cpr
(2)按樣本鮮重計(jì)算
單位定義:每g組織每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。
PPDK(nmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(W× V樣÷V樣總)÷T=1286×ΔA÷W
V反總:反應(yīng)體系總體積,2×10-4 L;ε:NADH摩爾消光系數(shù),6.22×103 L / mol /cm;d:96孔板光徑,0.5cm;V樣:加入樣本體積,0.01 mL;V樣總:加入提取液體積,1 mL;T:反應(yīng)時(shí)間,5 min;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g。
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