小鼠胚胎干細(xì)胞
ES-E14TG2a
細(xì)胞描述:
小鼠胚胎干細(xì)胞。該細(xì)胞缺乏 HGPRT(HPRT),并且對 0.06 mM 的 6-硫鳥嘌呤有抗性。當(dāng)在飼養(yǎng)層(胚胎成纖維細(xì)胞或 STO 細(xì)胞)上培養(yǎng)時,細(xì)胞保持未分化狀態(tài)。在沒有飼養(yǎng)層的情況下,細(xì)胞自發(fā)分化并形成胚胎結(jié)構(gòu)。當(dāng)注入胚泡中時,細(xì)胞可以進(jìn)入生殖系。在常規(guī)的分子基因修飾技術(shù)之后,它們可用于重構(gòu)小鼠胚胎。培養(yǎng)時需使用昆明白MEF作為飼養(yǎng)層細(xì)胞。
細(xì)胞特性
1) 來源:小鼠,129/Ola品系,胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)
2) 形態(tài):球形克隆 貼壁生長
3) 含量:>1x106 細(xì)胞數(shù)
4) 規(guī)格:1mL凍存管包裝
5) 用途:僅供科研使用
運輸和保存:干冰運輸:1mL凍存管包裝干冰運輸,收到后-80度冰箱保存過夜后轉(zhuǎn)入液氮或直接復(fù)蘇,若發(fā)現(xiàn)干冰已揮發(fā)干凈、凍存管瓶蓋脫落、破損及細(xì)胞有污染,請立即與我們聯(lián)系。
一.培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備:
1)準(zhǔn)備DMEM 基礎(chǔ)培養(yǎng)基 81%
優(yōu)質(zhì)胎牛血清 15 %
GlutaMAX-1谷氨酰胺 1 %
MEM NEAA非必需氨基酸 1%
Sodium Pyruvate丙酮酸鈉 1%
P/S青霉素-鏈霉素 1%
β-巰基乙醇 0.5 mL(1000X)
LIF 5μg(10ng/mL)
使用昆明白MEF作為飼養(yǎng)層細(xì)胞。
2)培養(yǎng)條件: 氣相:空氣,95%;二氧化碳,5%。 溫度:37℃,培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。
3)凍存液:完培養(yǎng)液 60%?,F(xiàn)BS 30%?,DMSO 10%?現(xiàn)用現(xiàn)配。
我?guī)靸龃鏁r,體積為 500 μl,預(yù)期存活率 70%,每支凍存管的細(xì)胞復(fù)蘇,3 至4 天后,會形成 30 至 40 個克隆,建議復(fù)蘇至 1 個 T25 培養(yǎng)瓶中。
二:細(xì)胞處理:
1. 在 T25 培養(yǎng)瓶中加入 0.2%明膠,搖勻后覆蓋底面即可,于 37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱至少放置 15 min 以上。
2. 吸除 0.2%明膠,加入事先水浴加熱至 37℃的 MEF 完培養(yǎng)液。一般地,一個 T25 培養(yǎng)瓶中加入 5 ml MEF 完培養(yǎng)液。
3. 按實驗需要:小鼠胚胎干細(xì)胞使用 KM-r P3 MEF 或 CF-1 P3 MEF;復(fù)蘇 MEF 細(xì)胞若干支。將凍存管從液氮中取出,置于37℃水浴中使之迅速融解,取出后拿到超凈臺內(nèi)用75%酒精擦拭凍存管旋口處及外壁,防止污染。
4. 將凍存管內(nèi)細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至含 2 ml MEF 完培養(yǎng)液的 15 ml 離心管內(nèi),以1000 rpm,離心 5 min,離心后將上清液吸除,另加入新鮮的 MEF 完培養(yǎng)液 1 ml,重懸后按照一個 T25 培養(yǎng)瓶鋪 1?106 的 MEF 細(xì)胞,平均加入到 T25 培養(yǎng)瓶中,輕輕搖勻后置于 37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱。24 h 以后可以傳入小鼠胚胎干細(xì)胞。
5.復(fù)蘇或傳代小鼠胚胎干細(xì)胞前,將 T25 培養(yǎng)瓶中的 MEF 完培養(yǎng)液吸除,加入 2 ml 小鼠胚胎干細(xì)胞完培養(yǎng)液輕輕沖洗一遍后吸除,加入新鮮的小鼠胚胎干細(xì)胞完培養(yǎng)液待用。
1.將小鼠胚胎干細(xì)胞凍存管從液氮中取出,置于 37℃水浴中使之迅速融解,取出后拿到超凈臺內(nèi)用 75?酒精擦拭凍存管旋口處及外壁,防止污染。
2. 將凍存管內(nèi)細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至含 3-4 ml 小鼠胚胎干細(xì)胞完培養(yǎng)液的 15ml 離心管內(nèi),以 1000 rpm,離心 5 min。
3. 離心后將上清液吸除,另加入新鮮的小鼠胚胎干細(xì)胞完培養(yǎng)液 2 ml,吹打懸浮。
4. 重復(fù)吹打,制成單細(xì)胞懸液,盡量避免氣泡。
5. 轉(zhuǎn)移至 1 個已經(jīng)鋪好 MEF 細(xì)胞的 T25 培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。
6. 每天更換小鼠胚胎干細(xì)胞完培養(yǎng)液。
傳代:
1. 一般在復(fù)蘇后第 2-3 天傳代,視克隆大小和密度而定
2. 吸除廢液。
3. 用 PBS(不含鈣鎂離子)輕輕沖洗一遍。
4. 加入 1.0 ml 的 0.25%胰酶(含 EDTA)至培養(yǎng)瓶,輕輕晃動,使胰酶覆蓋底面,置于 37℃培養(yǎng)箱內(nèi)消化細(xì)胞。
5. 在顯微鏡下觀察,直至細(xì)胞層全部脫落(一般需要 1-2 min)。
6. 加 2 ml 小鼠胚胎干細(xì)胞完培養(yǎng)液終止消化。
7. 以 1000 rpm,離心 5 min,棄上清。
8. 加入約 1 ml 小鼠胚胎干細(xì)胞完培養(yǎng)液,多次輕輕吹打細(xì)胞, 制成單細(xì)胞懸液。
9. 加入足量的小鼠胚胎干細(xì)胞完培養(yǎng)液,吹打混勻,細(xì)胞懸液分裝到鋪好 MEF 細(xì)胞的 T25 培養(yǎng)瓶中。一般地,一個 T25 培養(yǎng)瓶加入 5-6 ml 培養(yǎng)液。放入 37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。每天換液。
傳代比例:1:4-1:7
1.按傳代的方法將細(xì)胞消化下來,制成細(xì)胞懸液。
2. 以 1000 rpm,離心 5 min,棄上清,逐滴加入已經(jīng)預(yù)冷的凍存液,懸浮細(xì)胞。
3. 按每支存管內(nèi)加入 500 ml 細(xì)胞懸液分裝到凍存管內(nèi),標(biāo)記細(xì)胞名稱、代數(shù)、凍存日期等基本信息。
4.將凍存管置于程序降溫盒內(nèi),-80℃過夜,轉(zhuǎn)入液氮。
凍存液配方:
小鼠胚胎干細(xì)胞完培養(yǎng)液 60%,ES 級 FBS 30%,DMSO 10%
1.培養(yǎng)中的小鼠胚胎干細(xì)胞,按傳代的操作方法將細(xì)胞用胰酶消化并吹打成單細(xì)胞懸液后,加入適量的提前溫育好的小鼠胚胎干細(xì)胞完培養(yǎng)液重懸細(xì)胞, 吹打混勻,細(xì)胞懸液分裝到無 MEF 細(xì)胞的培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶(一般地,一個T25 培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)的小鼠胚胎干細(xì)胞,在一個 10 cm 培養(yǎng)皿中進(jìn)行差速貼壁。不要事先鋪明膠,如鋪明膠則細(xì)胞貼壁速度過快無法有效分離小鼠胚胎干細(xì)胞與 MEF 細(xì)胞)中。
2. 培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶置于 37°C 培養(yǎng)箱內(nèi)靜置 1 小時。
3. 1 小時后,絕大部分 MEF 細(xì)胞已貼在培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶底面,而大部分小鼠胚胎干細(xì)胞仍然懸浮在培養(yǎng)液中。收取培養(yǎng)液,進(jìn)行后續(xù)實驗。
注意事項:
1. 所有動物細(xì)胞均視為有潛在的生物危害性,必須在二級生物安全臺內(nèi)操作,并請注意防護(hù),所有廢液及接觸過此細(xì)胞的器皿需要滅菌后方能丟棄。
2. 建議在復(fù)蘇凍存細(xì)胞時始終使用防護(hù)手套、衣服和戴上防護(hù)面罩。注意:凍存管浸沒在液氮中會泄漏,并會慢慢充滿液氮。解凍時,液氮轉(zhuǎn)化成氣相可能導(dǎo)致容器爆炸或用危險力吹掉其蓋子,從而產(chǎn)生飛揚的碎屑造成人員傷害。
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