試劑盒說明書
微量法 100 管/48 樣
4CL 是連接苯丙酸途徑與木質(zhì)素特異合成途徑的關(guān)鍵酶,主要催化肉桂酸生成相應(yīng)的肉桂酸輔酶 A 酯,是合成木質(zhì)素與其他苯丙烷類化合物的代謝流向調(diào)控點(diǎn)。該酶主要存在于高等植物、酵母和菌類中,研究該酶可以探討多種生物細(xì)胞發(fā)育過程中木質(zhì)素沉積的代謝機(jī)理, 為減少水果石細(xì)胞含量而提高其品質(zhì)提供依據(jù)。
4CL 催化 4-香豆酸和 CoA 生成 4-香豆酸 CoA,在 333nm 下測(cè) 4-香豆酸 CoA 生成速率,即可反映 4CL 活性。
紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96 孔板(UV 板)、研缽、冰和蒸餾水。
提取液:100mL×1 瓶,4℃保存;
試劑一:液體 25 mL×1 瓶, 4℃保存; 試劑二:粉劑×2 瓶,-20℃保存;
細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞:先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi),離心后棄上清;按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量
(104 個(gè)):提取液體積(mL)為 500~1000:1 的比例(建議 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 提取液),超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞(冰浴,功率 20%或 200W,超聲 3s,間隔 10s,重復(fù) 30 次); 8000g 4℃離心 10min,取上清,置冰上待測(cè)。
組織:按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)為 1:5~10 的比例(建議稱取約 0.1g 組織,加入 1mL 提取液),進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min,取上清,置冰上待測(cè)。
1、 分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀 40℃預(yù)熱 30min 以上,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 333nm,蒸餾水調(diào)零。
2、 準(zhǔn)備 96 孔 UV 板一塊(非普通酶標(biāo)板,普通酶標(biāo)板只能透過可見光,不能透過紫外光, 檢測(cè)波長(zhǎng)小于 340nm 務(wù)必使用 UV 板)。
3、 樣本測(cè)定
(1) 在試劑二中加入 5mL 試劑一充分溶解混勻,置于 40℃水浴預(yù)熱 10min;現(xiàn)配現(xiàn)用( 配好后 24h 內(nèi)用完);
(2) 對(duì)照管:在微量石英比色皿或 96 孔 UV 板中加入 10μL 樣本和 190μL 試劑一,混勻,立即記錄 333nm 處 40℃反應(yīng) 30min 后的吸光值A(chǔ)1。
(3) 測(cè)定管:在微量石英比色皿或 96 孔 UV 板中加入 10μL 樣本和 190μL 試劑二,混勻,立即記錄 333nm 處 40℃反應(yīng) 30min 后的吸光值 A2,計(jì)算 ΔA=A2-A1。每個(gè)測(cè)定管設(shè)一個(gè)對(duì)照管。
4CL 活性計(jì)算:
a. 用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下
(1) 按樣本蛋白濃度計(jì)算:
單位定義:每 mg 組織蛋白每分鐘生成 1 nmol4-香豆酸輔酶A 定義為一個(gè)酶活力單位。
4CL(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V 反總÷(ε×d)×10 9]÷(V 樣×Cpr) ÷T= 31.75×ΔA÷Cpr
(2) 按樣本鮮重計(jì)算:
單位定義:每 g 組織每分鐘生成 1 nmol 4-香豆酸輔酶A 定義為一個(gè)酶活力單位。
4CL(nmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V 反總÷(ε×d)×10 9]÷(W ×V 樣÷V 樣總) ÷T= 31.75×ΔA÷W
(3) 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算:
單位定義:每 1 萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘生成 1 nmol 4-香豆酸輔酶A 定義為一個(gè)酶活力單位。
4CL(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V 反總÷(ε×d)×10 9]÷(500×V 樣÷V 樣總) ÷T= 0.063×ΔA
V 反總:反應(yīng)體系總體積,2×10 -4 L;ε:4-香豆酸輔酶 A 摩爾消光系數(shù),2.1×10 4 L / mol /cm;
d:比色皿光徑,1cm;V 樣:加入樣本體積,0.01 mL;V 樣總:加入提取液體積,1 mL;
T:反應(yīng)時(shí)間,30 min;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g;500:細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù),500 萬。
1)按樣本蛋白濃度計(jì)算:
單位的定義:每 mg 組織蛋白每分鐘生成 1 nmol 的 4-香豆酸輔酶A 定義為一個(gè)酶活力單位。
4CL(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V 反總÷(ε×d)×10 9]÷(V 樣×Cpr) ÷T= 63.49×ΔA÷Cpr
(2) 按樣本鮮重計(jì)算:
單位的定義:每 g 組織每分鐘生成 1 nmol 4-香豆酸輔酶A 定義為一個(gè)酶活力單位。
4CL(nmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V 反總÷(ε×d)×10 9]÷(W× V 樣÷V 樣總) ÷T= 63.49×ΔA÷W
(3) 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算:
單位的定義:每 1 萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘生成 1 nmol 4-香豆酸輔酶A 定義為一個(gè)酶活力單位。
4CL(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V 反總÷(ε×d)×10 9]÷(500×V 樣÷V 樣總)÷T= 0.127×ΔA
V 反總:反應(yīng)體系總體積,2×10 -4 L;ε:4-香豆酸輔酶 A 摩爾消光系數(shù),2.1×10 4 L / mol /cm;
d:96 孔板光徑,0.5cm;V 樣:加入樣本體積,0.01 mL;V 樣總:加入提取液體積,1 mL;
T:反應(yīng)時(shí)間,30 min;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g;500:細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù),500 萬。
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