人體腎臟細(xì)胞系

(HEK-293T)

細(xì)胞介紹

HEK-293T細(xì)胞是293T（293tsA1609neo）細(xì)胞系（ATCC CRL-11268）的衍生物。細(xì)胞持續(xù)表達(dá)SV40抗原，該細(xì)胞常用于轉(zhuǎn)染實驗，轉(zhuǎn)染效率較高。（轉(zhuǎn)染一般以50%密度鋪板，待細(xì)胞剛剛貼到皿壁上后（一般8-10小時），即可進行轉(zhuǎn)染操作）

細(xì)胞特性

1）  來源：人胚胎腎臟

2）  形態(tài)：上皮細(xì)胞樣，貼壁生長，貼壁能力較弱

3）  含量：>1x10⁶ 細(xì)胞數(shù)

4）  規(guī)格：T25瓶或者1mL凍存管包裝

5）  用途：僅供科研使用。

運輸和保存：干冰運輸及復(fù)蘇好存活細(xì)胞：（1）1mL凍存管包裝干冰運輸，收到后-80度冰箱保存過夜后轉(zhuǎn)入液氮或直接復(fù)蘇，若發(fā)現(xiàn)干冰已揮發(fā)干凈、凍存管瓶蓋脫落、破損及細(xì)胞有污染，請立即與我們聯(lián)系。（2）T25瓶復(fù)蘇的存活細(xì)胞常溫發(fā)貨，收到后按照細(xì)胞接收后的處理方法操作。

細(xì)胞接收后的處理：

1）收到細(xì)胞后，75%酒精消毒瓶壁將T25瓶置于37℃培養(yǎng)箱放置約2-3h，若發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)瓶破損、有液溢出及細(xì)胞有污染，請拍照后及時聯(lián)系我們。

2）請在4或5X顯微鏡下確認(rèn)細(xì)胞狀態(tài)，同時給剛收到的細(xì)胞拍照（10×，20×）各2-3張以及培養(yǎng)瓶外觀照片一張留存，作為售后時收到時細(xì)胞狀態(tài)的依據(jù)。

3）半貼細(xì)胞和貼壁不牢（懸浮）細(xì)胞：T25瓶置于37℃培養(yǎng)箱中約2-3h，顯微鏡下觀察細(xì)胞的情況，若細(xì)胞密度在60%以下，客戶需收集T25瓶中的懸浮細(xì)胞離心后用完培重懸后打回到原培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，若細(xì)胞生長70%-90%對細(xì)胞進行傳代，傳代時需要收集培養(yǎng)基中懸浮的細(xì)胞離心后回收。

4）備注：運輸用的培養(yǎng)基（灌液培養(yǎng)基）不能再用來培養(yǎng)細(xì)胞，請換用按照說明書細(xì)胞培養(yǎng)條件新配制的完培來培養(yǎng)細(xì)胞。  收到細(xì)胞后第一次傳代建議T25培養(yǎng)瓶1：2傳代 。

一．培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備：

1） 準(zhǔn)備DMEM培養(yǎng)基；優(yōu)質(zhì)胎牛血清，10%；L-谷氨酰胺（2mM）1%；NEAA  1% ； 雙抗 1%

注意：1.該細(xì)胞貼壁能力較弱，培養(yǎng)時可酌情使用預(yù)鋪0.2%明膠的培養(yǎng)瓶/培養(yǎng)皿。培養(yǎng)液中需添加熱滅活胎牛血清。細(xì)胞生長不能過密，過密細(xì)胞容易脫落，脫落下來的細(xì)胞可以通過離心收集，使用0.05% Trypsin-0.53 mM EDTA 消化后繼續(xù)培養(yǎng)。

2.如果發(fā)生293T細(xì)胞不貼壁，漂浮在培養(yǎng)基中的現(xiàn)象，請確認(rèn)所使用的DMEM中碳酸氫鈉濃度及培養(yǎng)箱中CO2濃度。并參考以下培養(yǎng)體系：

a) DMEM由1.5 g/L碳酸氫鈉配制而成，使用5％CO2培養(yǎng)箱。

b) DMEM由3.7 g/L碳酸氫鈉配制而成，使用10％CO2培養(yǎng)箱。

當(dāng)使用碳酸氫鈉含量高的培養(yǎng)基時，必須將這些細(xì)胞在10％CO2中孵育，以便正確緩沖培養(yǎng)基。當(dāng)培養(yǎng)基沒有適當(dāng)緩沖時，239T細(xì)胞雖然可以存活，但將無法粘附并保持漂浮在培養(yǎng)基中。

2） 培養(yǎng)條件： 氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37攝氏度，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。

3） 凍存液：90%FBS，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。

二． 細(xì)胞處理：

1）凍存細(xì)胞的復(fù)蘇：

將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入到含4-6mL完培的離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心3-5min，棄去上清液，完培重懸細(xì)胞。然后將細(xì)胞懸液加入含6-8ml完培的培養(yǎng)瓶（或皿）中37℃培養(yǎng)過夜。第二天顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況和細(xì)胞密度。

2） 細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)70%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。

該細(xì)胞為懸浮和輕微的貼壁細(xì)胞，傳代可以參考以下方法：

1. 收集：將培養(yǎng)瓶中的懸浮的細(xì)胞收集到離心管中。用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1-2次。由于細(xì)胞貼壁不牢PBS潤洗后細(xì)胞會脫落所以PBS也要回收到離心管中。

2. 加入0.25％（w / v）胰蛋白酶-0.53 mM EDTA于培養(yǎng)瓶中（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL）置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘（難消化的細(xì)胞可以適當(dāng)延長消化時間），然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加入3-4ml含10%FBS的培養(yǎng)基來終止消化。

3. 將收集到的懸浮細(xì)胞、pbs清洗液中的細(xì)胞和消化下來的貼壁細(xì)胞以1000rpml離心5min，棄去上清，補加1-2mL培養(yǎng)液后重懸混勻后將細(xì)胞懸液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照說明書要求配置的新的完培以保持細(xì)胞的生長活力，后續(xù)傳代根據(jù)實際情況按1:2~1:5的比例進行。

3） 細(xì)胞凍存: 收到細(xì)胞后建議在培養(yǎng)前3代時凍存一批細(xì)胞種子以備后續(xù)實驗使用。下面T25瓶為例；

1. 細(xì)胞凍存時按照細(xì)胞傳代的過程收集消化好的細(xì)胞到離心管中，可使用血球計數(shù)板計數(shù)，來決定細(xì)胞的凍存密度。一般細(xì)胞的推薦凍存密度為1×10⁶~1×10⁷個活細(xì)胞/ml.

2. 1000rpm離心3-5min，去掉上清。用配制好的細(xì)胞凍存液重懸細(xì)胞 ，按每1ml凍存液含1×10⁶~1×10⁷個活細(xì)胞/ml分配到一個凍存管中將細(xì)胞分配到凍存管中，標(biāo)注好名稱、代數(shù)、日期等信息。

3. 將要凍存的細(xì)胞置于程序降溫盒中，-80度冰箱中過夜，之后轉(zhuǎn)入液氮容器中儲存。同時記錄好凍存管在液氮容器中的位置以便后續(xù)查閱和使用。

注意事項：

1. 所有動物細(xì)胞均視為有潛在的生物危害性，必須在二級生物安全臺內(nèi)操作，并請注意防護，所有廢液及接觸過此細(xì)胞的器皿需要滅菌后方能丟棄。

2. 建議在復(fù)蘇凍存細(xì)胞時始終使用防護手套、衣服和戴上防護面罩。注意：凍存管浸沒在液氮中會泄漏，并會慢慢充滿液氮。解凍時，液氮轉(zhuǎn)化成氣相可能導(dǎo)致容器爆炸或用危險力吹掉其蓋子，從而產(chǎn)生飛揚的碎屑造成人員傷害。