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NALM-6 人B淋巴白血病細胞培養(yǎng)說明書

發(fā)布時間:2023/8/24      點擊次數(shù):651

人前B急性淋巴細胞白血病細胞

(Nalm-6)

 

細胞描述:

該細胞由19歲患有急性淋巴細胞白血?。?/span>ALL)的19歲男子的外周血建立,在1976年復發(fā)。

細胞特性:

來源:外周血

形態(tài):懸浮生長

含量:>1x106 細胞數(shù)

規(guī)格:T25瓶或者1mL凍存管包裝

用途:僅供科研使用。

 

運輸和保存:干冰運輸及復蘇好存活細胞:(11mL凍存管包裝干冰運輸,收到后-80度冰箱保存過夜后轉入液氮或直接復蘇,若發(fā)現(xiàn)干冰已揮發(fā)干凈、凍存管瓶蓋脫落、破損及細胞有污染,請立即與我們聯(lián)系。(2T25瓶復蘇的存活細胞常溫發(fā)貨,收到后按照細胞接收后的處理方法操作。

細胞接收后的處理:

1 收到細胞后,75%酒精消毒瓶壁將T25瓶置于37℃培養(yǎng)箱放置約2-3h,若發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)瓶破損、有液溢出及細胞有污染,請拍照后及時聯(lián)系我們。

2)請在45X顯微鏡下確認細胞狀態(tài),同時給剛收到的細胞拍照(10×,20×)各2-3張以及培養(yǎng)瓶外觀照片一張留存,作為售后時收到時細胞狀態(tài)的依據(jù)。

3 懸浮細胞:T25瓶置于37℃培養(yǎng)箱放置約2-3h,然后抽出瓶中的培養(yǎng)基和細胞1000rpm離心5分鐘,棄去上清重懸后接種到新的培養(yǎng)瓶中(加入按照說明書細胞培養(yǎng)條件新配制的完)。

4)備注:運輸用的培養(yǎng)基(灌液培養(yǎng)基)不能再用來培養(yǎng)細胞,請換用按照說明書細胞培養(yǎng)條件新配制的完來培養(yǎng)細胞。  收到細胞后第一次傳代建議T25培養(yǎng)瓶12傳代 。

                 

細胞培養(yǎng)步驟

一.培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準備:

1) 準備1640培養(yǎng)基;優(yōu)質胎牛血清,10%;雙抗,1%

2) 培養(yǎng)細胞時請注意
(1)
傳代時細胞的接種密度應控制在 1-4 活細胞/平方厘米。
(2)
選用高質量的胎牛血清配制培養(yǎng)液。

3) 培養(yǎng)條件: 氣相:空氣,95%;二氧化碳,5%。 溫度:37攝氏度,培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。

4) 凍存液:90%血清,10%DMSO,現(xiàn)用現(xiàn)配。

二. 細胞處理:

1)凍存細胞的復蘇::

將含有1mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍,加入到含4-6mL完培的離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心3-5min,棄去上清液,完重懸細胞。然后將細胞懸液加入含6-8ml的培養(yǎng)瓶(或皿)中37℃培養(yǎng)過夜。第二天顯微鏡下觀察細胞生長情況和細胞密度。

2)細胞傳代如果細胞密度達80%-90%,即可進行傳代培養(yǎng)。

對于懸浮細胞,傳代可參考以下方法:

懸浮狀態(tài)下生長的細胞,可以通過向培養(yǎng)瓶中添加完來維持細胞的生長狀態(tài),一般情況下細胞密度維持在1×105~1×106/mL(不同細胞對密度要求不同,)可以維持細胞的正常生長。如需分瓶可以將細胞懸液收集到離心管中1000rpm,離心5min,棄去上清,補加1-2mL培養(yǎng)液后重懸混勻后將細胞懸液按12的比例分到新T25瓶中,添加6-8ml按照說明書要求配置的新的完以保持細胞的生長活力,后續(xù)傳代根據(jù)實際情況按1:2~1:5的比例進行。

3)細胞凍存: 收到細胞后建議在培養(yǎng)前3代時凍存一批細胞種子以備后續(xù)實驗使用。下面T25瓶為例;

1. 細胞凍存時按照細胞傳代的過程收集消化好的細胞到離心管中,可使用血球計數(shù)板計數(shù),來決定細胞的凍存密度。一般細胞的推薦凍存密度為1×106~1×107個活細胞/ml.

2. 1000rpm離心3-5min,去掉上清。用配制好的細胞凍存液重懸細胞 ,按每1ml凍存液含1×106~1×107個活細胞/ml分配到一個凍存管中將細胞分配到凍存管中,標注好名稱、代數(shù)、日期等信息。

3. 將要凍存的細胞置于程序降溫盒中,-80度冰箱中過夜,之后轉入液氮容器中儲存。同時記錄好凍存管在液氮容器中的位置以便后續(xù)查閱和使用。

 

注意事項:

1. 所有動物細胞均視為有潛在的生物危害性,必須在二級生物安全臺內(nèi)操作,并請注意防護,所有廢液及接觸過此細胞的器皿需要滅菌后方能丟棄。

2. 建議在復蘇凍存細胞時始終使用防護手套、衣服和戴上防護面罩。注意:凍存管浸沒在液氮中會泄漏,并會慢慢充滿液氮。解凍時,液氮轉化成氣相可能導致容器爆炸或用危險力吹掉其蓋子,從而產(chǎn)生飛揚的碎屑造成人員傷害。


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