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甲基檸檬酸合酶(metheyl-citrate synthase,MCS)試劑盒說明書

發(fā)布時間:2023/6/11      點擊次數(shù):313

甲基檸檬酸合酶(metheyl-citrate synthase,MCS)試劑盒說明書

                                         微量法100/96

 

   意 :正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定

測定意義:                           

MCS廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細胞的線粒體基質中,與檸檬酸合酶(CS)共同參與三羧酸循環(huán)的調節(jié)。

 

測定原理:

MCS催化丙酰CoA和草酰乙酸產生甲基檸檬酰輔酶A,進一步水解產生甲基檸檬酸;該反應促使無色的DTNB轉變成黃色的TNB,在 412nm處有特征吸光值。

 

需自備的儀器和用品:

可見分光光度計/酶標儀、臺式離心機、水浴鍋、可調式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰、無水乙醇和蒸餾水

 

試劑組成和配制:

試劑一:液體100mL×1瓶,-20保存;

試劑二:液體20mL×1瓶,-20保存;

試劑三:液體1.5mL×1支,-20保存;

試劑四:液體30mL×1瓶,4保存;

試劑五:粉劑×1瓶,4保存;

試劑六:粉劑×1支,-20保存,臨用前加入1mL蒸餾水,用不完的試劑仍-20保存;

 

樣本的前處理:

組織、細菌或細胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離:

        稱取約0.1g組織或收集500萬細胞,加入1mL試劑一和10uL 試劑三,用冰浴勻漿器或研缽勻漿。

        將勻漿600g,4離心5min。

        棄沉淀,將上清液移至另一離心管中,11000g,4離心10min。

        上清液即胞漿提取物,可用于測定從線粒體泄漏的CS(此步可選做)。

        在步驟④的沉淀中加入200uL試劑二和2uL 試劑三,超聲波破碎(冰浴,功率20%或200W,超聲3秒,間隔10秒,重復30次),用于線粒體CS測定。

 

測定步驟:

1、分光光度計或酶標儀預熱30min以上,調節(jié)波長至412nm,蒸餾水調零。

2、樣本測定

1)在試劑五中加入1mL無水乙醇和22mL試劑四,混勻,37℃(哺乳動物)或25℃(其它物種)孵育5min用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復凍融;

2)在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL樣本、220μL試劑五和10μL試劑六,混勻,記錄412nm20秒時的初始吸光度A1220秒時的吸光度A2,計算ΔA=A2-A1。

 

MCS活性計算:

a.        使用微量石英比色皿測定的計算公式如下:

1)按樣本蛋白濃度計算:

單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘催化產生1 nmol TNB定義為一個酶活力單位。

MCSnmol/min /mg prot)=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷(V×Cpr) ÷T=880×ΔA÷Cpr

此法需要自行測定樣本蛋白質濃度。

2)按樣本鮮重計算:

單位的定義:每g組織每分鐘催化產生1 nmol TNB定義為一個酶活力單位。

MCSnmol/min /g 鮮重)=[ΔA×V反總÷ε×d×109W× V÷V樣總)÷T=177.8×ΔA÷W

3)按細菌或細胞密度計算:

單位的定義:每1萬個細菌或細胞每分鐘催化產生1 nmol TNB定義為一個酶活力單位。

MCSnmol/min /104 cell=[ΔA×V反總÷ε×d×109500×V÷V樣總)÷T=0.3556×ΔA

V反總:反應體系總體積,2.4×10-4 L;εTNB摩爾消光系數(shù),1.36×104 L / mol /cm;d:比色皿光徑,1cm;V樣:加入樣本體積,0.01 mL;V樣總:加入提取液體積,0.202 mL;T:反應時間,2 min;Cpr:樣本蛋白質濃度,mg/mLW:樣本質量,g;500:細胞或細菌總數(shù),500萬。

 

b.       使用96孔板測定的計算公式如下:

1)按樣本蛋白濃度計算:

單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘催化產生1 nmol TNB定義為一個酶活力單位。

MCSnmol/min /mg prot)=[ΔA×V反總÷ε×d×109]÷(V×Cpr) ÷T=1760×ΔA÷Cpr

此法需要自行測定樣本蛋白質濃度。

2)按樣本鮮重計算:

單位的定義:每g組織每分鐘催化產生1 nmol TNB定義為一個酶活力單位。

MCSnmol/min /g 鮮重)=[ΔA×V反總÷ε×d×109W ×V÷V樣總)÷T=355.6×ΔA÷W

3)按細菌或細胞密度計算:

單位的定義:每1萬個細菌或細胞每分鐘催化產生1 nmol TNB定義為一個酶活力單位。

MCSnmol/min /104 cell=[ΔA×V反總÷ε×d×109500×V÷V樣總)÷T=0.711×ΔA

V反總:反應體系總體積,2.4×10-4 L;εTNB摩爾消光系數(shù),1.36×104 L / mol /cmd96孔板光徑,0.5cmV樣:加入樣本體積,0.01 mL;V樣總:加入提取液體積,0.202 mL;T:反應時間,2 minCpr:樣本蛋白質濃度,mg/mL;W:樣本質量,g500:細胞或細菌總數(shù),500萬。

 

配方

試劑一:液體100mL×1瓶,4保存;(50mM Tris-HCl 7.48.56g 蔗糖,88mg EDTA

試劑二:液體20mL×1瓶,4保存;(10mM Tris-HCl 7.41Trixton-100)

試劑三:液體1.5mL×1支,4保存;(100mM PMSF)

試劑四:液體×1瓶,4保存;(稱0.135g Tris,0.166g KCl8.4mgEDTA,溶于27.5mL雙蒸水,用HCl調pH7.5

試劑五:粉劑×1瓶,4保存;(稱取2mg DTNB,2mg 丙二酰CoA30mL試劑瓶)

試劑六:粉劑×1支,-20保存;(稱取0.6mg草酰乙酸于1.5mLEP管)


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