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細(xì)胞壁不溶性酸性轉(zhuǎn)化酶(B-AI)試劑盒說明書

發(fā)布時(shí)間:2023/5/22      點(diǎn)擊次數(shù):252

細(xì)胞壁不溶性酸性轉(zhuǎn)化酶(cell-wall binding acid invertase, B-AI試劑盒說明書

                                          微量法100/48

 

 

   意 :正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義:

蔗糖轉(zhuǎn)化酶(Invertase,Ivr)催化蔗糖不可逆地分解為果糖和葡萄糖,是高等植物蔗糖代謝關(guān)鍵酶之一。根據(jù)最適 pH,Ivr分為酸性轉(zhuǎn)化酶(AI)和中性轉(zhuǎn)化酶(NI)兩種類型。                           

AI的最適pH35。AI分為可溶性AI(S-AI)和細(xì)胞壁不溶性AIB-AI)兩種類型。B-AI存在于細(xì)胞間隙并結(jié)合在細(xì)胞壁上,主要參與韌皮部質(zhì)外體卸載時(shí)蔗糖的分解,以維持庫(kù)源之間蔗糖的濃度。

 

測(cè)定原理:

B-AI催化蔗糖降解產(chǎn)生還原糖,進(jìn)一步與3,5-二硝基水楊酸反應(yīng),生成棕紅色氨基化合物,在510nm有特征光吸收,在一定范圍內(nèi)510nm光吸收增加速率與B-AI活性成正比。

 

自備用品:

可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。

 

試劑組成和配制:

提取液1:液體100mL×1瓶,4保存;

提取液2:液體100mL×1瓶,4保存;

試劑一:液體20mL×1瓶,4保存;

試劑二:粉劑×1瓶,4保存;臨用前加入10mL試劑一充分溶解備用;用不完的試劑4保存;

試劑三:液體15mL×1瓶,4保存;

 

粗酶液提?。?/span>

按照組織質(zhì)量(g):提取液1體積(mL)15~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL提取液1),進(jìn)行冰浴勻漿。12000g 4離心10min,棄上清,沉淀中加入1mL蒸餾水,充分震蕩混勻,12000g 4離心10min,棄上清,沉淀中加入1mL提取液2 充分混勻,4浸提過夜,12000g 4離心20min,取上清置冰上待測(cè)。

 

測(cè)定步驟和加樣表:

1、   分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至510nm,蒸餾水調(diào)零。

2、樣本測(cè)定,(在EP管中依次加入下列試劑):

試劑名稱(μL

測(cè)定管

對(duì)照管

樣本

50

50

試劑一


200

試劑二

200


混勻, 37準(zhǔn)確水浴30min,95水浴10min(蓋緊,以防水分散失),流水冷卻后充分混勻(以保證濃度不變)

試劑三   

125

125

混勻,95水浴10min(蓋緊,以防止水分散失),流水冷卻后充分混勻,取200μL至微量石英比色皿或96孔板中, 510nm處記錄各管吸光值A,如果吸光值大于2,可以用蒸餾水稀釋后測(cè)定(計(jì)算公式中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)),ΔA=A測(cè)定-A對(duì)照。每個(gè)測(cè)定管設(shè)一個(gè)對(duì)照管。

 

B-AI活性計(jì)算:

a.用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定的回歸方程為y = 0.0016x -0.001x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度(μg/mL),y為吸光值。

1)按蛋白濃度計(jì)算:

單位的定義:37mg蛋白每分鐘產(chǎn)生1μg還原糖定義為一個(gè)酶活性單位。

B-AI活性(μg /min/mg prot)=[(ΔA +0.001) ÷0.0016×V1]÷(V1×Cpr ) ÷T=20.8×(ΔA +0.001) ÷Cpr

2)按鮮重計(jì)算:

單位的定義:37g組織每分鐘產(chǎn)生1μg還原糖定義為一個(gè)酶活性單位。

B-AI活性(μg /min /g鮮重)=[(ΔA +0.001) ÷0.0016×V1]÷(W×V1÷V2) ÷T=20.8×(ΔA +0.001) ÷W

V1:加入反應(yīng)體系中樣本體積,0.05mL;V2:加入提取液體積,1mL;T:反應(yīng)時(shí)間,30min; Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mLW:樣本鮮重,g。

 

b.96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定的回歸方程為y = 0.0008x -0.001;x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度(μg/mL),y為吸光值。

1)按蛋白濃度計(jì)算:

單位的定義:37mg蛋白每分鐘產(chǎn)生1μg還原糖定義為一個(gè)酶活性單位。

B-AI活性(μg /min /mg prot)=[(ΔA +0.001) ÷0.0008×V1]÷(V1×Cpr ) ÷T=41.6×(ΔA +0.001) ÷Cpr

2)按鮮重計(jì)算:

單位的定義:37g組織每分鐘產(chǎn)生1μg還原糖定義為一個(gè)酶活性單位。

B-AI活性(μg /min /g鮮重)=[(ΔA +0.001) ÷0.0008×V1]÷(W ×V1÷V2) ÷T =41.6×(ΔA +0.001) ÷W

V1:加入反應(yīng)體系中樣本體積,0.05mL;V2:加入提取液體積,1mL;T:反應(yīng)時(shí)間,30min Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本鮮重,g


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