脂肪酶(LPS)活性試劑盒說明書
微量法100T/96S
注 意:正式測定之前選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。
測定意義:
LPS又稱甘油酯水解酶,催化甘油三酯水解生成脂肪酸和甘油(或者甘油二酯和單酯)。LPS廣泛的存在于各種生物中。血清中LPS的異常增高常見于胰腺炎和胰腺癌。
測定原理:
LPS催化油酯水解成脂肪酸,利用銅皂法測定脂肪酸生成速率,即可計算LPS活性。
自備儀器和用品:
研缽、臺式離心機、震蕩混勻器、可見分光光度計/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板、可調(diào)式移液槍、甲苯80mL、冰和蒸餾水。
試劑組成和配制:
試劑一:液體65mL×2瓶,4℃保存。
試劑二:液體10mL×1瓶,4℃保存。每次使用前用震蕩混勻器劇烈震蕩20min。
試劑三:甲苯80mL×1瓶,4℃保存(自備)。
試劑四:液體10mL×1瓶,4℃保存。
標(biāo)準(zhǔn)品:液體10 μL×1瓶,10 µmol/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液,4℃保存。臨用前加入3.168 mL甲苯,充分溶解。
粗酶液提?。?/span>
1. 組織:按照組織質(zhì)量(g):試劑一體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL試劑一)進行冰浴勻漿。12000g,4℃離心10min,取上清置冰上待測。
2. 細菌、真菌:按照細胞數(shù)量(104個):試劑一體積(mL)為500~1000:1的比例(建議500萬細胞加入1mL試劑一),冰浴超聲波破碎細胞(功率300w,超聲3秒,間隔7秒,總時間3min);然后12000g,4℃,離心10min,取上清置于冰上待測。
3. 血清等液體: 直接檢測。
LPS測定操作:
1. 分光光度計/酶標(biāo)儀預(yù)熱30 min,調(diào)節(jié)波長到710 nm,蒸餾水調(diào)零。
2. 試劑一和試劑二置于37℃水浴預(yù)熱30min。
3. 在1.5mL EP管中依次加入下列試劑
試劑名稱(μL) | 空白管 | 測定管 |
蒸餾水 | 150 | |
樣本 | 50 | |
試劑一 | 300 | 300 |
試劑二 | 100 |
37℃振蕩反應(yīng)10 min
試劑三 | 800 | 800 |
37℃振蕩反應(yīng)10 min后,8000g,25℃,離心10min,取上清液
試劑名稱(μL) | 空白管 | 測定管 | 標(biāo)準(zhǔn)管 |
上清液 | 400 | 400 | |
標(biāo)準(zhǔn)品 | 400 | ||
試劑四 | 100 | 100 | 100 |
37℃振蕩反應(yīng)5 min后,靜置5min,取200μL上層液加入微量石英比色皿/96孔板,于710nm處測定吸光值。
注意:空白管和標(biāo)準(zhǔn)管只需測定一次。
LPS活性計算公式:
1. 組織、細菌或細胞LPS活性
(1)按照蛋白濃度計算
活性單位定義:37℃中每毫克蛋白每分鐘水解橄欖油生成1μmol脂肪酸為一個酶活單位。
LPS (μmol/min/mg prot) = [C標(biāo)準(zhǔn)品×(A測定管-A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)- A空白管)]×V反總÷(Cpr×V樣)÷T
=16×[(A測定管-A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管- A空白管)]÷Cpr
(2)按照樣本質(zhì)量計算
活性單位定義:37℃中每克組織每分鐘水解橄欖油生成1μmol脂肪酸為一個酶活單位。
LPS (μmol/min/g 鮮重) = [C標(biāo)準(zhǔn)品×(A測定管-A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管- A空白管)]×V反總÷(W×V樣÷V樣總)÷T
=16×[(A測定管-A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管- A空白管)]÷W
(3)按照細菌或者細胞數(shù)量計算
活性單位定義:37℃中每104個細胞每分鐘水解橄欖油生成1μmol脂肪酸為一個酶活單位。
LPS (μmol /min/104cell) = [C標(biāo)準(zhǔn)品×(A測定管-A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管- A空白管)]×V反總÷(細胞數(shù)量×V樣÷V樣總)÷T
=16×[(A測定管-A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管- A空白管)]÷細胞數(shù)量
2. 血清等液體LPS活性
活性單位定義:37℃中每毫升血清每分鐘水解橄欖油生成1μmol脂肪酸為一個酶活單位。
LPS (μmol /min/mL) = [C標(biāo)準(zhǔn)品×(A測定管-A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管- A空白管)]×V反總÷V樣÷T
=16×[(A測定管-A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管- A空白管)]
C標(biāo)準(zhǔn)品:10 µmol/mL;V反總:反應(yīng)總體積,0.8mL;V樣:反應(yīng)中加入樣本體積,0.05mL;V樣總:加入提取液體積,1mL;Cpr:上清液蛋白質(zhì)濃度,mg/mL,需要另外測定,建議使用本公司BCA蛋白質(zhì)含量測定試劑盒;W:樣本質(zhì)量,g;T:催化反應(yīng)時間,10 min。
電話
微信掃一掃