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線粒體復(fù)合體Ⅰ試劑盒說明書

發(fā)布時(shí)間:2023/4/26      點(diǎn)擊次數(shù):307

線粒體復(fù)合體試劑盒說明書

 

微量法100/96

 

注 意正式測定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定

 

測定意義

 

復(fù)合體EC 1.6.5. 3又稱 NADH-CoQ 還原酶或 NADH 脫氫酶,廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞的線粒體中,是線粒體內(nèi)膜中最大的蛋白復(fù)合物。該酶催化一對電子從 NADH 傳遞給 CoQ,同時(shí)可使 O2 還原生成 O2.-,是呼吸電子傳遞鏈上產(chǎn)生 O2.-的主要部位。測定該酶活性,不僅可以反映呼吸電子傳遞鏈(ETC)狀態(tài),而且可以反映活性氧(ROS)生成狀態(tài)。

 


測定原理

 

復(fù)合體能夠催化 NADH 脫氫生成 NAD+,在 340nm 下測定 NADH 的氧化速率計(jì)算出該酶活性的大小。

 


需自備的儀器和用品

 

紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研缽、冰和蒸餾水。

 


試劑的組成和配制

 

試劑一:液體 100mL×1 瓶,-20保存;

 

試劑二:液體 20mL×1 瓶,-20保存;

 

試劑三:液體 1.5mL×1 瓶,-20保存;

 

試劑四:液體 25mL×1 瓶,-20保存;

 

試劑五:液體 1mL×1 支,-20保存;

 

試劑六:粉劑×1 支,-20保存,用時(shí)加入 2mL 蒸餾水;用不完的試劑分裝后-20保存,禁止反復(fù)凍融。

 

工作液的配制:臨用前將試劑五轉(zhuǎn)移到試劑四中混合溶解;用不完的試劑分裝后-20保存,禁止反復(fù)凍融。

 

樣本的前處理:

 

組織、細(xì)菌或細(xì)胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離:

 

     準(zhǔn)確稱取 0.1g 組織或收集 500 萬細(xì)胞,加入 1mL 試劑一和 10uL 試劑三,用冰浴勻漿器或研缽勻漿。

 

     將勻漿 600g,4離心 5min。

 

     棄沉淀,將上清液移至另一離心管中,11000g,4離心 10min。

 

     上清液即為除去線粒體的胞漿蛋白,可用于測定從線粒體泄漏的復(fù)合體(此步可選做)。

 

     步驟中的沉淀即為線粒體,加入 200uL 試劑二和 2uL 試劑三,超聲波破碎(冰浴,功率 20%或 200W,超聲 3s,間隔 10 秒,重復(fù) 30 次),用于復(fù)合體酶活性測定。

 

 

測定步驟:

 

1、 分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上,調(diào)節(jié)波長至 340nm,蒸餾水調(diào)零。

 

2、 樣本測定

 

1)工作液于 37(哺乳動物)或 25(其它物種)孵育 5min。

 

2)在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 10μL 樣本、200μL 工作液和 15μL 試劑六,混勻,記錄 340nm 處初始吸光值 A1 2min 后的吸光值 A2,計(jì)算 ΔA=A1-A2

 

  


復(fù)合體活力單位的計(jì)算

 

a.使用微量石英比色皿測定的計(jì)算公式如下:

 

1)按蛋白濃度計(jì)算

 

單位的定義:每 mg 組織蛋白每分鐘消耗 1 nmol NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。

 

復(fù)合體活力(nmol/min /mg prot=[ΔA×V 反總÷ε×d×109]÷(V ×Cpr) ÷T=1808×ΔA÷Cpr

 

此法需要自行測定樣本蛋白質(zhì)濃度。

 

2) 按樣本鮮重計(jì)算

 

單位的定義:每 g 組織每分鐘消耗 1 nmol NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。

 

復(fù)合體活力(nmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V 反總÷ε×d×109]÷(W× V ÷V 樣總)

 

÷T=365×ΔA÷W

 

3) 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

 

單位的定義:每 1 萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘消耗 1 nmol NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。

 

復(fù)合體活力(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V 反總÷ε×d×109]÷(500×V ÷V 樣總) ÷T=0.73×ΔA

 

V  反總:反應(yīng)體系總體積,2.25×10-4 LεNADH 摩爾消光系數(shù),6.22×103 L / mol /cm;d

 

比色皿光徑,1cmV 樣:加入樣本體積,0.01 mL;V 樣總:加入提取液體積,0.202 mL;T:反應(yīng)時(shí)間,2 min;W:樣本質(zhì)量,g500:細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù),500 萬。

 

b.使用 96 孔板測定的計(jì)算公式如下:

 

1)按蛋白濃度計(jì)算

 

單位的定義:每 mg 組織蛋白每分鐘消耗 1 nmol NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。

 

復(fù)合體活力(nmol/min/mg prot=[ΔA×V 反總÷ε×d×109]÷(V ×Cpr) ÷T=3616×ΔA÷Cpr

 

此法需要自行測定樣本蛋白質(zhì)濃度。

 

2) 按樣本鮮重計(jì)算

 

單位的定義:每 g 組織每分鐘消耗 1 nmol NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。

 

復(fù)合體活力(nmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V 反總÷ε×d×109]÷(W× V ÷V 樣總)

 

÷T=730×ΔA÷W

 

3) 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

 

單位的定義:每 1 萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘消耗 1 nmol NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。

 

復(fù)合體活力(nmol/min/104 cell=[ΔA×V 反總÷ε×d×109]÷(500×V ÷V 樣總) ÷T=1.46×ΔA

 

V  反總:反應(yīng)體系總體積,2.25×10-4 L;εNADH 摩爾消光系數(shù),6.22×103 L / mol /cm;d

 

96 孔板光徑,0.5cm;V 樣:加入樣本體積,0.01 mL;V 樣總:加入提取液體積,0.202 mL;T:反應(yīng)時(shí)間,2 min;W:樣本質(zhì)量,g;500:細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù),500 萬。


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