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NADH氧化酶(NADH oxidase,NOX)試劑盒說明書

發(fā)布時間:2023/4/25      點擊次數:300

NADH氧化酶(NADH oxidase,NOX)試劑盒說明書

                                      微量法 100/96

 

    正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定

測定意義:

NOXEC 1.6.99.3)廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細胞中,可在氧氣存在下,直接將NADH氧化為NAD。該酶不僅參與NAD的再生,而且與免疫反應密切相關。

 

測定原理:

NOX能夠將NADH氧化為NADNADH的氧化與2,6二氯酚靛藍(DCPIP)的還原相偶聯(lián),藍色的DCPIP被還原為無色的DCPIP,在600nm下測定藍色DCPIP的還原速率計算出NADH氧化酶活性的大小。

需自備的儀器和用品:

可見分光光度計/酶標儀、臺式離心機、水浴鍋、可調式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰、蒸餾水

 

試劑的組成和配制:

試劑一:液體100mL×1瓶,-20保存;

試劑二:液體20mL×1瓶,-20保存;

試劑三:液體1.5mL×1瓶,-20保存;

試劑四:液體25mL×1瓶,4保存。

試劑五粉劑×1瓶,-20保存;臨用前加入5mL蒸餾水,用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復凍融。

 

樣本的前處理:

組織、細菌或細胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離:

        準確稱取0.1g組織或收集500萬細胞,加入1mL試劑一和10uL 試劑三,用冰浴勻漿器或研缽勻漿。

        將勻漿600g4離心5min。

        棄沉淀,將上清液移至另一離心管中,11100g,4離心10min。

        上清液即為除去線粒體的胞漿蛋白,可用于測定從線粒體泄漏的NOX(此步可選做)。

        步驟④中的沉淀即為線粒體,加入200uL試劑二和2uL 試劑三,超聲波破碎(冰浴,功率20%或200W,超聲3s,間隔10秒,重復30次),用于NOX活性測定。

血清(漿)樣品:直接檢測。

 

測定步驟:

1、  分光光度計或酶標儀預熱30min以上,調節(jié)波長至600nm,蒸餾水調零。

2、  樣本測定

1)試劑四于37℃(哺乳動物)或25℃(其它物種)孵育5min。

2)在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL樣本、200μL試劑四和40μL試劑五,混勻,記錄600nm20s時吸光值A1 1min20s后的吸光值A2,計算ΔA=A1-A2。

 

NOX活力單位的計算:

a. 用微量石英比色皿測定的計算公式如下

1、血清(漿)NOX活力的計算:

單位的定義:每mL血清(漿)在每mL反應體系中每分鐘A600變化0.01定義為一個酶活力單位。

NOXU/mL)=ΔA×V反總÷V÷0.01÷T=2500×ΔA

2、組織、細菌或細胞中NOX活力的計算:

1)按樣本蛋白濃度計算:

單位的定義:每mg組織蛋白在每mL反應體系中每分鐘A600變化0.01定義為一個酶活力單位。

NOXU/mg prot=ΔA×V反總÷V×Cpr÷0.01÷T=2500×ΔA÷Cpr

此法需要自行測定樣本蛋白質濃度。

2)按樣本鮮重計算:

單位的定義:每g組織在每mL反應體系中每分鐘A600變化0.01定義為一個酶活力單位。

NOXU/g 鮮重)=ΔA×V反總÷(W× V÷V樣總)÷0.01÷T=505×ΔA÷W

3)按細菌或細胞密度計算:

單位的定義:每1萬個細菌或細胞在每mL反應體系中每分鐘A600變化0.01定義為一個酶活力單位。

NOXU/104 cell=ΔA×V反總÷(500×V÷V樣總)÷0.01÷T=1.01×ΔA

V反總:反應體系總體積,0.25mL; V樣:加入樣本體積,0.01mLV樣總:加入提取液體積,0.202 mL;T:反應時間,1 minCpr:樣本蛋白質濃度,mg/mL;W:樣本質量;500:細胞或細菌總數,500萬。

 

b. 使用96孔板測定的計算公式如下:

1、血清(漿)NOX活力的計算:

單位的定義:每mL血清(漿)在每mL反應體系中每分鐘A600變化0.005定義為一個酶活力單位。

NOXU/mL)=ΔA×V反總÷V÷0.01÷T=5000×ΔA

2、組織、細菌或細胞中NOX活力的計算:

1)按樣本蛋白濃度計算:

單位的定義:每mg組織蛋白在每mL反應體系中每分鐘A600變化0.005定義為一個酶活力單位。

NOXU/mg prot=ΔA×V反總÷V×Cpr÷0.005÷T=5000×ΔA÷Cpr

此法需要自行測定樣本蛋白質濃度。

2)按樣本鮮重計算:

單位的定義:每g組織在每mL反應體系中每分鐘A600變化0.005定義為一個酶活力單位。

NOXU/g 鮮重)=ΔA×V反總÷(W× V÷V樣總)÷0.005÷T=1010×ΔA÷W

3)按細菌或細胞密度計算:

單位的定義:每1萬個細菌或細胞在每mL反應體系中每分鐘A600變化0.005定義為一個酶活力單位。

NOXU/104 cell=ΔA×V反總÷(500×V÷V樣總)÷0.005÷T=2.02×ΔA

V反總:反應體系總體積,0.25mL; V樣:加入樣本體積,0.01mL;V樣總:加入提取液體積,0.202 mL;T:反應時間,1 min;Cpr:樣本蛋白質濃度,mg/mL;W:樣本質量;500:細胞或細菌總數,500萬。


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