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硝酸還原酶(NR)活性測定試劑盒說明書

發(fā)布時間:2023/4/9      點擊次數(shù):280

硝酸還原酶(Nitrate Reductase,NR)活性測定試劑盒說明書

                                   微量法100/96

   意:正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定

測定意義

NR EC 1.7.1.3廣泛存在于植物中,是植物硝態(tài)氮轉化為氨態(tài)氮的關鍵酶,也是誘導酶,對作物的產量和品質有影響。

測定原理

NR催化硝酸鹽還原為亞硝酸鹽,NO3ˉ +NADH+H→ NO2ˉ +NAD +H 2 O;產生的亞硝酸鹽能夠在酸性條件下,與對氨基苯磺酸及 α - 萘胺定量生成紅色偶氮化合物;生成的紅色偶氮化合物在 540 nm 有最大吸收峰,可用分光光度法測定。

需自備的儀器和用品

可見分光光度計/酶標儀、水浴鍋、臺式離心機、可調式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配制

誘導劑儲備液:液體50mL×1瓶,4保存。

提取液:液體60mL×1瓶,4保存。

試劑一:液體10mL×1瓶,-20保存。

試劑二:液體5mL×1瓶,-20保存;

試劑三:液體6mL×1瓶,4保存(如出現(xiàn)結晶析出,60-90℃水浴溶解后使用);

試劑四:液體6mL×1瓶,4保存。

試劑五:標準儲備液1mL,-20保存。

誘導劑應用液的配制:用時將誘導劑儲備液稀釋10倍,即取10mL誘導劑儲備液90mL蒸餾水,充分混勻。

0.1umol/mL的標準液的配制:用時將試劑五稀釋100倍,即取 0.1ml試劑五加9.9mL蒸餾水,充分混勻。

樣本前處理

動植物組織樣品的前處理:

1取適量誘導劑于燒杯中,將新鮮標本洗凈,濾紙吸干,放入誘導劑應用液中(淹沒即可),浸泡2h,取出樣本,濾紙吸干。

2按照組織質量(g):提取液體積(mL)15~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL提取液),進行冰浴勻漿。8000g 4離心10min,取上清,置冰上待測。

注意:

1、   建議使用新鮮沒有冷凍過的樣本。

2、   一般不要誘導處理,預測定結果沒有活性(A測定≤A對照管)則需要誘導處理。

細菌或培養(yǎng)細胞的前處理:

先收集細菌或細胞到離心管內,離心后棄上清;按照細菌或細胞數(shù)量(104個):提取液體積(mL)為500~10001的比例(建議500萬細菌或細胞加入1mL提取液),超聲波破碎細菌或細胞(冰浴,功率20%或200W,超聲3s,間隔10s,重復30次);8000g 4離心10min,取上清,置冰上待測。

測定步驟

1、分光光度計或酶標儀預熱30min以上,調節(jié)波長至540nm,蒸餾水調零。

2、樣本測定(在EP管或96孔板中加入下列試劑)

試劑名稱(μL

加樣孔

測定管

對照管

標準管

空白管

樣本

20

20



0.1μmol/mL標準液



20


蒸餾水


75


95

試劑一

75


75


試劑二

25

25

25

25

    混勻后,37℃(哺乳動物)或25℃(其它物種)反應30min

試劑三

50

50

50

50

試劑四

50

50

50

50

混勻,25室溫顯色20min540nm處比色

注意1、標準管和空白管只需測一次,每個測定管設一個對照管。

     2、誘導處理后的樣本對照管中試劑二改成加25μL蒸餾水。

NR活性計算:

1)按樣本鮮重計算:

單位定義:每小時每g鮮重樣品中催化產生 1μmol NO2ˉ的量為一個 NR活力單位。

NRμmol/h/g 鮮重= (C標準管×V1)×A測定管-A對照管)÷A標準管-A空白管)÷(W×V1÷V2)÷T=0.2×A測定管-A對照管)÷A標準管-A空白管)÷W

2)按樣本蛋白濃度計算:

單位定義:每小時每mg組織蛋白催化產生 1μmol NO2ˉ的量為一個 NR活力單位。

NRμmol/h/mg prot=(C標準管×V1)×A測定管-A對照管)÷A標準管-A空白管)÷(V1×Cpr)÷T=0.2×A測定管-A對照管)÷A標準管-A空白管)÷Cpr

C標準管:標準管濃度,0.1μmol/mLV1:加入樣本體積:0.02mL;V2:加入提取液體積,1mL;T:反應時間,0.5h;Cpr:樣本蛋白質濃度,mg/mLW:樣本鮮重,g。



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