谷氨酸脫氫酶(Glutamate dehydrogenase,GDH)試劑盒說明書
微量法100管/96樣
注 意:正式測定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定
測定意義:
GDH(EC 1.4.1.2)廣泛分布于植物中,和谷氨酸合成酶(GOGAT)共同參與谷氨酸的合成,在氨同化和轉(zhuǎn)化成有機(jī)氮化合物的代謝中起重要作用。
測定原理:
GDH催化NH4+、α-酮戊二酸和NADH,生成谷氨酸和NAD+,引起340nm吸光度下降。通過測定340nm吸光度的下降速率,計(jì)算GDH活性。
需自備的儀器和用品:
紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。
試劑組成和配制:
提取液:液體100mL×1瓶,4℃保存;
試劑一:液體20mL×1瓶,4℃保存;
試劑二:粉劑×2瓶,4℃保存;
粗酶液提?。?/span>
細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞:先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi),離心后棄上清;按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量(104個(gè)):提取液體積(mL)為500~1000:1的比例(建議500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液),超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞(冰浴,功率20%或200W,超聲3s,間隔10s,重復(fù)30次);8000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測。
組織:按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL提取液),進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測。
血清(漿)樣品:直接檢測。
測定步驟:
1、 分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長至340nm,蒸餾水調(diào)零。
2、 樣本測定
(1)在試劑二中加入10mL試劑一充分溶解混勻,置于37℃(哺乳動(dòng)物)或25℃(其它物種)水浴5min;現(xiàn)配現(xiàn)用(配好后12h內(nèi)用完);
(2)在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL樣本和190μL試劑二,混勻,立即記錄340nm處20s時(shí)的吸光值A1和 5min20s后的吸光值A2,計(jì)算ΔA=A1-A2。
GDH活性計(jì)算:
a.用微量石英比色皿測定的計(jì)算公式如下
1、血清(漿)中GDH活力的計(jì)算:
單位的定義:每毫升血清(漿)每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。
GDH(nmol/min/mL)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷V樣÷T=643×ΔA
2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中GDH活力的計(jì)算:
(1)按樣本蛋白濃度計(jì)算:
單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。
GDH(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=643×ΔA÷Cpr
(2)按樣本鮮重計(jì)算:
單位的定義:每g組織每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。
GDH(nmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(W× V樣÷V樣總) ÷T=643×ΔA÷W
(3)按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算:
單位的定義:每1萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。
GDH(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T=1.286×ΔA
V反總:反應(yīng)體系總體積,2×10-4 L;ε:NADH摩爾消光系數(shù),6.22×103 L / mol /cm;d:比色皿光徑,1cm;V樣:加入樣本體積,0.01 mL;V樣總:加入提取液體積,1 mL;T:反應(yīng)時(shí)間,5 min;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g;500:細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù),500萬。
b.用96孔板測定的計(jì)算公式如下
1、血清(漿)中GDH活力的計(jì)算:
單位的定義:每毫升血清(漿)每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。
GDH(nmol/min /mL)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷V樣÷T=1286×ΔA
2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中GDH活力的計(jì)算:
(1)按樣本蛋白濃度計(jì)算:
單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。
GDH(nmol/min /mg prot)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=1286×ΔA÷Cpr
(2)按樣本鮮重計(jì)算:
單位的定義:每g組織每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。
GDH(nmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(W ×V樣÷V樣總) ÷T=1286×ΔA÷W
(3)按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算:
單位的定義:每1萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。
GDH(nmol/min /104 cell)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T=2.572×ΔA
V反總:反應(yīng)體系總體積,2×10-4 L;ε:NADH摩爾消光系數(shù),6.22×103 L / mol /cm;d:96孔板光徑,0.5cm;V樣:加入樣本體積,0.01 mL;V樣總:加入提取液體積,1 mL;T:反應(yīng)時(shí)間,5 min;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g;500:細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù),500萬。
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