脯氨酸(PRO)含量測(cè)定試劑盒說(shuō)明書
微量法100管/96樣
注 意 :正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定
測(cè)定意義:
Pro廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中,逆境條件下,植物體內(nèi)Pro含量顯著增加。Pro增加量在一定程度上反映了抗逆性,抗旱性強(qiáng)的品種往往積累較多的脯氨酸。因此,脯氨酸增加量可以作為抗逆育種的生理指標(biāo)之一。
測(cè)定原理:
用磺基水楊酸(SA)提取Pro,加熱處理后,Pro與酸性茚三酮溶液反應(yīng)生成紅色;加甲苯萃取后,在520nm測(cè)定吸光度。
需自備的儀器和用品:
可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、冰乙酸25mL、甲苯50mL、研缽、冰和蒸餾水。
試劑的組成和配制:
提取液:液體100mL×1瓶,4℃保存。
試劑一:冰乙酸25 mL×1瓶, 4℃保存。(自備)
試劑二:液體25 mL×1瓶, 4℃保存。
試劑三:甲苯50mL×1瓶,4℃保存。(自備)
樣品測(cè)定的準(zhǔn)備:
1、細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備:
細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞:先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi),離心后棄上清;按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量(104個(gè)):提取液體積(mL)為500~1000:1的比例(建議500萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液),超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞(冰浴,功率20%或200W,超聲3s,間隔10s,重復(fù)30次);之后置90℃振蕩提取10min;10000g,25℃離心10min,取上清,冷卻后待測(cè)。
組織:按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL提取液),進(jìn)行冰浴勻漿;之后置90℃振蕩提取10min;10000g,25℃離心10min,取上清,冷卻后待測(cè)。
2、血清(漿)樣品:按照血清(漿)體積(mL):提取液體積(mL)為1:5~10的比例(建議取0.1mL血清(漿)加入1mL提取液),充分混勻,之后置90℃浴振蕩提取10分鐘,10000g,25℃離心10分鐘,取上清,冷卻后待測(cè)。
測(cè)定步驟:
1、 分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至520nm,蒸餾水調(diào)零。
2、 樣本測(cè)定:
(1) 取0.25mL樣本+0.25mL試劑一+0.25mL試劑二 于有蓋EP管中,置沸水浴中保溫30min(蓋緊,防止水分散失),每10min振蕩一次。
(2) 待冷卻后,加入0.5mL試劑三,振蕩30s,靜置片刻,使色素轉(zhuǎn)至試劑三中;吸取0.2mL上層溶液于微量石英比色皿或96孔板中,于520nm波長(zhǎng)處比色,記錄吸光值A。
Pro含量計(jì)算:
a.用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下
1、典型回歸方程y = 0.0521x - 0.0021 (x為脯氨酸含量,μg/mL;y為吸光值A)
2、按照血清(漿)體積計(jì)算
Pro含量(μg/mL)=[(A+0.0021) ÷0.0521×V1]÷(V3×V1÷V2)=192×(A+0.0021)
3、按照蛋白濃度計(jì)算
Pro含量(μg/mg prot)=[(A+0.0021) ÷0.0521×V1]÷(V1×Cpr)=19.2×(A+0.0021)÷Cpr
4、按照樣本質(zhì)量計(jì)算
Pro含量(µg/g鮮重)= [(A+0.0021) ÷0.0521×V1]÷(W×V1÷V2)=19.2×(A+0.0021) ÷W
5、按照細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算
Pro含量(μg/104 cell)=[(A+0.0021) ÷0.0521×V1]÷(500×V1÷V2)=0.0384×(A+0.0021)
V1:加入反應(yīng)體系中樣本體積,0.25mL;V2:加入提取液體積,1 mL;V3:加入血清(漿)體積,0.1 mL;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g;500:細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù),500萬(wàn)。
b.用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下
1、典型回歸方程y = 0.02605x - 0.0021 (x為脯氨酸含量,μg/mL;y為吸光值A)
2、按照血清(漿)體積計(jì)算
Pro含量(μg/mL)=[(A+0.0021) ÷0.02605×V1]÷(V3×V1÷V2)=384×(A+0.0021)
3、按照蛋白濃度計(jì)算
Pro含量(μg/mg prot)=[(A+0.0021) ÷0.02605×V1]÷(V1×Cpr)=38.4×(A+0.0021)÷Cpr
4、按照樣本質(zhì)量計(jì)算
Pro含量(µg/g鮮重)= [(A+0.0021) ÷0.02605×V1]÷(W×V1÷V2)=38.4×(A+0.0021) ÷W
3、按照細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算
Pro含量(μg/104 cell)=[(A+0.0021) ÷0.02605×V1]÷(500×V1÷V2)=0.0769×(A+0.0021)
V1:加入反應(yīng)體系中樣本體積,0.25mL;V2:加入提取液體積,1 mL;V3:加入血清(漿)體積,0.1 mL;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g;500:細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù),500萬(wàn)。
注意:Z低檢測(cè)限為1μg/mL。
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