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鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶(δ-OAT)生化試劑盒說明書

發(fā)布時間:2023/3/31      點擊次數(shù):277

鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶(nithine-δ-aminotransferase ,δ-OAT)試劑盒說明書

                                                    微量法100T/96S

 

   正式測定之前選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。

測定意義:

脯氨酸是植物體內(nèi)適應(yīng)逆境脅迫的一種重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)。高等植物中脯氨酸代謝因其初始底物不同,分為谷氨酸( Glu) 和鳥氨酸( Orn) 兩條合成途徑。鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶( δ-OAT) 是以鳥氨酸為前體合成脯氨酸途徑的關(guān)鍵酶,對植物適應(yīng)逆境脅迫起關(guān)鍵作用。

 

測定原理:

鳥氨酸和α-酮戊二酸在鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶和NADH作用下發(fā)生氨基轉(zhuǎn)移反應(yīng)生成吡咯啉-5-羧酸(P5C),同時產(chǎn)生NAD,通過檢測340nm處的吸光度的變化可反映出鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶活性的高低。

 

自備實驗用品及儀器:

天平、低溫離心機(jī)、研缽、酶標(biāo)儀、96孔板。

 

試劑組成和配制:

提取液:液體110mL×1瓶,4℃保存。

試劑一:液體30 mL×1瓶,4℃保存。

試劑二:粉劑×1瓶,4℃保存;臨用前加8mL試劑一充分溶解;用不完的試劑4℃保存。

試劑三:粉劑×1瓶,4℃保存;臨用前加8mL試劑一充分溶解;用不完的試劑4℃保存。

試劑四:粉劑×2瓶,-20℃保存;臨用前每瓶加4mL試劑一充分溶解;現(xiàn)配現(xiàn)用。

 

酶液提?。?/span>

1.        組織:按照質(zhì)量(g):提取液體積(mL)15~10的比例(建議稱取約0.1g,加入1mL提取液)加入提取液,冰浴勻漿后于4℃,10000g離心10min,取上清置冰上待測。

2.        細(xì)胞:按照細(xì)胞數(shù)量(104個):提取液體積(mL)為500~10001的比例(建議500萬細(xì)胞加入1mL提取液),冰浴超聲波破碎細(xì)胞(功率300w,超聲3秒,間隔7秒,總時間3min);然后4℃,10000g離心10min,取上清置冰上待測。

3.        液體:直接檢測。

 

測定操作:

1.        酶標(biāo)儀預(yù)熱30min,調(diào)節(jié)波長至340nm。

2.        將配好的試劑二、三、四37℃預(yù)熱5min。(注意:粉劑試劑需要自行配制)

3.        96孔板,依次加入60μL試劑二,60μL試劑三,60μL試劑四,20μL粗酶液,充分混勻,記錄340nm處初始吸光值和37℃反應(yīng)10min的吸光值A2,△A=A1-A2。

4.        計算公式:

 

 

96孔板測定的計算公式如下

1)按照樣本蛋白濃度計算

 

酶活單位定義:每毫克組織蛋白每分鐘消耗1 nmolNADH定義為一個酶活力單位。

δ-OATnmol/min /mg prot=ΔA÷ε×d×V反總÷(V×Cpr) ÷T

=321.54×ΔA÷Cpr

2)按照樣本質(zhì)量計算

酶活單位定義:每組織每分鐘消耗1 nmolNADH定義為一個酶活力單位。

δ-OATnmol/min /g 鮮重=ΔA÷ε×d×V反總÷(W ×V÷V樣總) ÷T

=321.54×ΔA÷W

 

3)按照細(xì)胞數(shù)量計算

酶活單位定義:每104個細(xì)胞每分鐘消耗1 nmolNADH定義為一個酶活力單位。

δ-OATnmol/min /104 cell= ΔA÷ε×d×V反總÷(V×細(xì)胞數(shù)量÷V樣總) ÷T

=321.54×ΔA÷細(xì)胞數(shù)量

4)按照液體體積計算

酶活單位定義:每毫升液體每分鐘消耗1 nmolNADH定義為一個酶活力單位。

δ-OATnmol/min /mL)=ΔA÷ε×d×V反總÷V÷T

=321.54×ΔA

V反總:反應(yīng)體系總體積,0.2mL;εNADH摩爾消光系數(shù),6.22×103 L / mol /cm;d96孔板光徑,0.5cmV樣:加入樣本體積,0.02mL;V樣總:加入提取液體積,1mL;T:反應(yīng)時間,10 min;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mLW:樣本質(zhì)量,g


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