谷氨酸(glutamic acid,Glu)含量測定試劑盒說明書
微量法100管/96樣
注 意 :正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定
測定意義:
Glu廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細胞中,不僅是組成蛋白質的20種氨基酸之一,而且通過轉氨基作用參與多種氨基酸合成,是生物體內主要氨基來源之一。此外,Glu還是味精的主要有效成分,常用做食品添加劑以及香料生產(chǎn)。
測定原理:
利用專用提取液提取,然后用顯色劑進行顯色,顯色后在570nm下進行測定。
需自備的儀器和用品:
可見分光光度計/酶標儀、臺式離心機、可調式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰、蒸餾水。
試劑的組成和配制:
試劑一:液體120mL×1瓶,4℃保存;
試劑二:粉劑×1瓶, 4℃保存;臨用前加入5mL蒸餾水充分溶解混勻,用不完的試劑仍 4℃保存。
谷氨酸提?。?
1、細菌或培養(yǎng)細胞樣品:先收集細菌或細胞到離心管內,離心后棄上清;按照細菌或細胞數(shù)量(104個):試劑一體積(mL)為500~1000:1的比例(建議500萬細菌或細胞加入1mL試劑一),超聲波破碎細菌或細胞(冰浴,功率20%或200W,超聲3s,間隔10s,重復30次);8000g 常溫離心10min,取上清,置冰上待測。
2、組織樣品:按照組織質量(g):試劑一體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL試劑一),進行冰浴勻漿。8000g 常溫離心10min,取上清,置冰上待測。
3、血清(漿)或細胞培養(yǎng)液樣品:按照血清(漿)或細胞培養(yǎng)液體積(mL):試劑一體積(mL)為1:5~10的比例(建議取0.1mL血清(漿)或者細胞培養(yǎng)液加入1mL試劑一),進行冰浴勻漿。8000g 常溫離心10min,取上清,置冰上待測。
測定步驟
1、 分光光度計或酶標儀預熱30min以上,調節(jié)波長至570nm,蒸餾水調零。
2、 在有蓋EP管中加入下列試劑:
試劑名稱(μL) | 測定管 | 對照管 |
樣本 | 250 | |
試劑一 | 250 | |
試劑二 | 50 | 50 |
混勻,90℃水浴20min(蓋緊,以防止水分散失),流水冷卻,取200uL至微量石英比色皿或96孔板中,于570nm波長處記錄吸光值A。△A=A測定管-A對照管。對照管只要做一管。
谷氨酸含量計算:
a.用微量石英比色皿測定的計算公式如下
1、標準條件下測定回歸方程為y = 0.0074x- 0.5255;x為谷氨酸含量(µg/mL),y為吸光值。
2、按照血清(漿)或者細胞培養(yǎng)液體積計算
谷氨酸含量(μg/mL)= [(△A +0.5255)÷0.0074×V1]÷(V3×V1÷V2)=1351×(△A+0.5255)
3、按照蛋白濃度計算
谷氨酸含量(µg/mg prot)=[(△A +0.5255)÷0.0074×V1]÷(V1×Cpr)=135.1×(△A+0.5255) ÷Cpr
4、按照樣本質量計算
谷氨酸含量(µg/g鮮重)=[(△A +0.5255)÷0.0074×V1]÷(W ×V1÷V2)=135.1×(△A+0.5255) ÷W
5、按照細菌或細胞密度計算
谷氨酸含量(μg/104 cell)=[(△A +0.5255)÷0.0074×V1]÷(500×V1÷V2)=0.27×(△A+0.5255)
V1:加入反應體系中樣本體積,0.25mL;V2:加入提取液體積,1 mL;V3:加入血清(漿)或細胞培養(yǎng)液體積,0.1 mL; Cpr:樣本蛋白質濃度,mg/mL;W:樣本質量,g;500:細菌或細胞總數(shù),500萬。
b.用96孔板測定的計算公式如下
1、標準條件下測定回歸方程為y = 0.0037x- 0.5255; x為谷氨酸含量(µg/mL),y為吸光值。
2、按照血清(漿)或者細胞培養(yǎng)液體積計算
谷氨酸含量(μg/mL)= [(△A +0.5255)÷0.0037×V1]÷(V3×V1÷V2)=2703×(△A+0.5255)
3、按照蛋白濃度計算
谷氨酸含量(µg/mg prot)=[(△A +0.5255)÷0.0164×V1]÷(V1×Cpr)=270.3×(△A+0.5255) ÷Cpr
4、按照樣本質量計算
谷氨酸含量(µg/g鮮重)= [(△A +0.5255)÷0.0164×V1]÷(W ×V1÷V2)=270.3×(△A+0.5255) ÷W
5、按照細菌或細胞密度計算
谷氨酸含量(μg/104 cell)=[(△A +0.5255)÷0.0164×V1]÷(500×V1÷V2)=0.541×(△A+0.5255)
V1:加入反應體系中樣本體積,0.25mL;V2:加入提取液體積,1 mL;V3:加入血清(漿)或細胞培養(yǎng)液體積,0.1 mL; Cpr:樣本蛋白質濃度,mg/mL;W:樣本質量,g;500:細菌或細胞總數(shù),500萬。
注 意:
1、該試劑盒僅適用于發(fā)酵液或組織中谷氨酸含量測定,檢測下限為100µg/mL。
2、標準曲線線性范圍為:100µg/mL -600µg/mL。
3、ΔA線性范圍為:0.01-1;若大于1則需要將上清液用試劑一稀釋至適當倍數(shù)后測定,計算公式中乘以相應稀釋倍數(shù)。
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