紅霉素-N-脫甲基酶(ERND)活性測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)
微量法 100T/48S
注 意:正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。
測(cè)定意義:
細(xì)胞色素P450酶是一組主要存在于肝臟的酶系,在外源物質(zhì)代謝中,尤其是藥物和毒物的代謝,具有重要作用。ERND在P450酶系中相當(dāng)于CYP2B亞型,與藥物代謝的去甲基化密切相關(guān)。CYP2B具有催化底物形成非活性易于排泄的代謝產(chǎn)物而具有解毒作用,也可使某些藥物經(jīng)CYP2B代謝活化。
測(cè)定原理:
ERND催化紅霉素釋放甲醛,通過(guò)Nash比色測(cè)定甲醛含量,即可計(jì)算出ERND活性。
自備儀器和用品:
普通離心機(jī),超速離心機(jī)、可調(diào)式移液槍、可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板、蒸餾水和冰。
試劑組成和配置:
試劑一:粉劑×1瓶,4℃保存。臨用前加100mL蒸餾水溶解。
試劑二:液體×1瓶,4℃保存。
試劑三:粉劑×1管,4℃保存。臨用前加1mL蒸餾水,充分溶解。
試劑四:粉劑×1瓶,4℃保存。臨用前加0.5mL蒸餾水,充分溶解。
試劑五:粉劑×1瓶,4℃保存。臨用前,加蒸餾水4.5mL充分溶解。
試劑六:液體×1瓶,4℃保存。
試劑七:液體×1瓶,4℃保存。
標(biāo)準(zhǔn)液:液體×1瓶,-20℃保存。臨用前取1.5mL EP 管,加入10μl標(biāo)準(zhǔn)液,加990μl蒸餾水,混勻即為0.05 mmol/L標(biāo)準(zhǔn)甲醛溶液,4℃保存。
粗酶液提?。?/span>
1、除去細(xì)胞核,線粒體等大分子物質(zhì):稱(chēng)約0.5g組織,加入1mL試劑一,冰上充分研磨,10 000g 4℃離心30min,取上清液,轉(zhuǎn)入超速離心管中。
2、粗制微粒體:100 000g,4℃,離心60min,棄上清液。
3、除血紅蛋白等雜質(zhì):向步驟2的沉淀中加1mL試劑一,蓋緊后充分震蕩溶解,100 000g離心30min,棄上清液。
4、最終微粒體:向步驟3的沉淀中加試劑二0.5mL,充分震蕩溶解,即粗酶液,待測(cè)。該待測(cè)液需當(dāng)天使用。
測(cè)定操作:
1. 分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30 min,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到412 nm,蒸餾水調(diào)零。
2. 試劑二置于37℃水浴中預(yù)熱30 min。
3. 對(duì)照管:取0.5mL EP管,加入10μL粗酶液,170μL試劑二,10μL試劑三,10μL蒸餾水,混勻后置于37℃水浴保溫30min;立即加入35μL試劑五,混勻后置于冰浴中5min;取出后加入35μL試劑六,混勻后室溫靜置5min;室溫8000rpm離心5min;取新的EP管,加入100μL上清液,100μL試劑七,混勻后60℃
水浴10min,然后取出,用冷水冷卻5min,于412nm測(cè)定光吸收,記為A對(duì)照管。
4. 測(cè)定管:取0.5mL EP管,加入10μL粗酶液,170μL試劑二,10μL試劑三,10μL試劑四,混勻后置于37℃水浴保溫30min;立即加入35μL試劑五,混勻后置于冰浴中5min;取出后加入35μL試劑六,混勻后室溫靜置5min;室溫8000rpm離心5min;取新EP管,加入100μL上清液,100μL試劑七,混勻后60℃水浴10min,然后取出,用冷水冷卻5min,于412nm測(cè)定光吸收,記為A測(cè)定管。
5. 標(biāo)準(zhǔn)管:取0.5mL EP管,加入100μL標(biāo)準(zhǔn)品,100μL試劑七,混勻后60℃水浴10min,然后取出,用冷水冷卻5min,于412nm測(cè)定光吸收,記為A標(biāo)準(zhǔn)管。
注意:每個(gè)樣品都需要做對(duì)照管。
ERND活性計(jì)算公式:
a.使用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下
(1). 按照蛋白濃度計(jì)算:
活性單位定義:37℃下,每分鐘每毫克蛋白催化產(chǎn)生1nmol甲醛為1個(gè)酶活單位。
ERND活性(nmol/min/mg prot) = C標(biāo)準(zhǔn)品×V標(biāo)準(zhǔn)品×(A測(cè)定管-A對(duì)照管)÷A標(biāo)準(zhǔn)管×稀釋倍數(shù)÷(Cpr×V樣)÷T
= 45×(A測(cè)定管-A對(duì)照管)÷A標(biāo)準(zhǔn)管÷Cpr。
(2). 按照樣本質(zhì)量計(jì)算:
活性單位定義:37℃下,每分鐘每克樣品催化產(chǎn)生1nmol甲醛為1個(gè)酶活單位。
ERND活性(nmol/min/g 鮮重) = C標(biāo)準(zhǔn)品×V標(biāo)準(zhǔn)品×(A測(cè)定管-A對(duì)照管)÷A標(biāo)準(zhǔn)管×稀釋倍數(shù)÷(W×V樣)÷T
= 45×(A測(cè)定管-A對(duì)照管)÷A標(biāo)準(zhǔn)管÷W
C標(biāo)準(zhǔn)品:0.05 mmol/L=50μmol/L;V標(biāo)準(zhǔn)品:100μL=1×10-4 L;稀釋倍數(shù):V反總÷V上清液=(50+850 +50+50+175+175)÷500=2.7;Cpr:粗酶液蛋白質(zhì)濃度(mg/mL),需要另外測(cè)定,建議使用本公司BCA蛋白質(zhì)含量測(cè)定試劑盒;W:樣品質(zhì)量,g;V樣:加入粗酶液體積,10μL=0.01mL;T:催化反應(yīng)時(shí)間(min),30min。
b.使用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下
(1). 按照蛋白濃度計(jì)算:
活性單位定義:37℃下,每分鐘每毫克蛋白催化產(chǎn)生1nmol甲醛為1個(gè)酶活單位。
ERND活性(nmol/min/mg prot) = C標(biāo)準(zhǔn)品×V標(biāo)準(zhǔn)品×(A測(cè)定管-A對(duì)照管)÷A標(biāo)準(zhǔn)管×稀釋倍數(shù)÷(Cpr×V樣)÷T
= 45×(A測(cè)定管-A對(duì)照管)÷A標(biāo)準(zhǔn)管÷Cpr。
(2). 按照樣本質(zhì)量計(jì)算:
活性單位定義:37℃下,每分鐘每克樣品催化產(chǎn)生1nmol甲醛為1個(gè)酶活單位。
ERND活性(nmol/min/g 鮮重) = C標(biāo)準(zhǔn)品×V標(biāo)準(zhǔn)品×(A測(cè)定管-A對(duì)照管)÷A標(biāo)準(zhǔn)管×稀釋倍數(shù)÷(W×V樣)÷T
= 45×(A測(cè)定管-A對(duì)照管)÷A標(biāo)準(zhǔn)管÷W
C標(biāo)準(zhǔn)品:0.05 mmol/L=50μmol/L;V標(biāo)準(zhǔn)品:100μL=1×10-4 L;稀釋倍數(shù):V反總÷V上清液=(50+850 +50+50+175+175)÷500=2.7;Cpr:粗酶液蛋白質(zhì)濃度(mg/mL),需要另外測(cè)定,建議使用本公司BCA蛋白質(zhì)含量測(cè)定試劑盒;W:樣品質(zhì)量,g;V樣:加入粗酶液體積,10μL=0.01mL; T:催化反應(yīng)時(shí)間(min),30min。
電話
微信掃一掃