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魚(yú)類神經(jīng)壞死病毒(VNN)核酸檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)

發(fā)布時(shí)間:2023/3/28      點(diǎn)擊次數(shù):868

魚(yú)類神經(jīng)壞死病毒(VNN)核酸檢測(cè)試劑盒(熒光-PCR 法)

 【產(chǎn)品名稱】

商品名稱:魚(yú)類神經(jīng)壞死病毒(VNN)核酸檢測(cè)試劑盒(熒光-PCR 法)

Name :Viral Nervous Necrosis Virus Detection Kit (Real-Time PCR Method)

【包裝規(guī)格】50T/盒

【預(yù)期用途】

魚(yú)病毒性神經(jīng)壞死病又稱為病毒性腦病和視網(wǎng)膜病,是一種嚴(yán)重危害魚(yú)類魚(yú)苗的病毒性疾病。病原為病毒性神經(jīng)壞死病毒(Viral nervous necrosis virus, VNNV),屬乙型野田村病毒屬成員[1]。其臨床癥狀為一系列與神經(jīng)有關(guān)的異常表現(xiàn)。魚(yú)苗具不正常的螺旋狀或旋轉(zhuǎn)式游動(dòng)或靜止時(shí)腹部朝上,一旦用手觸碰病魚(yú),病魚(yú)會(huì)立即游動(dòng)等現(xiàn)象,魚(yú)體體色異常蒼白。不同種類的魚(yú)臨床癥狀不同,有的魚(yú)苗會(huì)出現(xiàn)鰾過(guò)度膨脹,有的病魚(yú)厭食、消瘦等。發(fā)病嚴(yán)重的魚(yú)苗伴隨著ji高的死亡率[1-2]。

本試劑盒適用于檢測(cè)的魚(yú)的腦、眼等標(biāo)本中魚(yú)類神經(jīng)壞死病毒 RNA,適用于魚(yú)類神經(jīng)壞死病毒感染的輔助診斷。

【檢驗(yàn)原理】

本試劑盒對(duì)魚(yú)類神經(jīng)壞死病毒基因設(shè)計(jì)特異性的引物和探針[2-3],用一步法熒光 RT-PCR 技術(shù)對(duì)魚(yú)類神經(jīng)壞死病毒RNA 進(jìn)行體外擴(kuò)增檢測(cè),用于臨床上對(duì)可疑感染者的病原學(xué)診斷。

【試劑組成】

名          稱

規(guī)         格

酶液

50μL×1   管

VNN 反應(yīng)液

500μL×2   管

VNN 陽(yáng)性質(zhì)控品

50μL   ×1 管

陰性質(zhì)控品

250μL   ×1 管

注:

1)  不同批號(hào)試劑不能混用。

2)  試劑盒內(nèi)各試劑組份足夠包裝規(guī)格所標(biāo)示的檢測(cè)次數(shù)。

【儲(chǔ)存條件及有效期】

-20℃±5℃,避光保存、運(yùn)輸、反復(fù)凍融次數(shù)不超過(guò) 5 次,有效期 12 個(gè)月。

【適用儀器】

ABI 、安捷倫 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列

熒光定量 PCR 檢測(cè)儀。

【標(biāo)本采集】

取魚(yú)類的腦和眼,魚(yú)苗和較小的仔魚(yú)取整條魚(yú)。

【保存和運(yùn)輸】

上述標(biāo)本短期內(nèi)可保存于-20℃,長(zhǎng)期保存可置-70℃,但不能超過(guò) 6 個(gè)月,標(biāo)

本運(yùn)送應(yīng)采用 2~8℃冰袋運(yùn)輸,嚴(yán)禁反復(fù)凍融。

【使用方法】

1.  樣品處理(樣本處理區(qū))

1.1  樣本前處理

每份組織分別從 3 個(gè)不同的位置稱取樣品約 1g,手術(shù)剪剪碎混勻后取 0.5g 于研磨器中研磨,加入 1.5mL 生理鹽水后繼續(xù)研磨,待勻漿后轉(zhuǎn)至 1.5mL 滅菌離心管中, 8000rpm 離心 2min,取上清液 100μL 于 1.5mL 滅菌離心管中。

1.2  RNA 提取

推薦采用優(yōu)利科(上海)生命科學(xué)有限公司生產(chǎn)的 RNA 提取試劑盒(離心柱提取法),

請(qǐng)按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

2.  試劑配制(試劑準(zhǔn)備區(qū))

根據(jù)待檢測(cè)樣本總數(shù),設(shè)所需要的 PCR 反應(yīng)管管數(shù)為 N(N=樣本數(shù)+1 管陰性對(duì)照+1 管陽(yáng)性對(duì)照;反應(yīng)管數(shù)每滿 10 份,多配制 1 份),每測(cè)試反應(yīng)體系配制如下表:

試劑

VNN   反應(yīng)液

酶液

用量

20μL

1μL

將混合好的測(cè)試反應(yīng)液分裝到 PCR 反應(yīng)管中,21uL/管。

3.  加樣(樣本處理區(qū))

將步驟 1 提取的 RNA、陽(yáng)性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品各取 4μL,分別加入相應(yīng)的反應(yīng)管中,蓋好管蓋,混勻,短暫離心。

4.  PCR 擴(kuò)增(核酸擴(kuò)增區(qū))

4.1  將待檢測(cè)反應(yīng)管置于熒光定量 PCR 儀反應(yīng)槽內(nèi);


 

4.2  設(shè)置好通道、樣品信息,反應(yīng)體系設(shè)置為 25μL;熒光通道選擇:

檢測(cè)通道(Reporter Dye)FAM, 淬滅通道(Quencher Dye)NONE,ABI 系列儀器請(qǐng)勿選擇 ROX 參比熒光,選擇 None 即可。

4.3  推薦循環(huán)參數(shù)設(shè)置:

步驟

循環(huán)數(shù)

溫度

時(shí)間

收集熒光信號(hào)

1

1   cycle

42℃

20min

2

1   cycle

95℃

10min

3

40 cycles

94℃

15sec

55℃

30sec

5.  結(jié)果分析判定

5.1  結(jié)果分析條件設(shè)定

設(shè)置 Baseline 和 Threshold:一般直接按機(jī)器自動(dòng)分析的結(jié)果分析,當(dāng)曲線出現(xiàn)整體傾斜時(shí),根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié) Baseline 的 start 值(一般可在 3~15 范圍內(nèi)調(diào)節(jié))、stop 值(一般可在 5~20 范圍內(nèi)調(diào)節(jié)),以及 Threshold 的 Value 值(上下拖動(dòng)閾值線至高于陰性對(duì)照),重新分析結(jié)果。

5.2  結(jié)果判斷

陽(yáng)性:檢測(cè)通道 Ct 值≤35,且曲線有明顯的指數(shù)增長(zhǎng)曲線;

可疑:檢測(cè)通道 35<Ct 值≤38,建議重復(fù)檢測(cè),如果檢測(cè)通道仍為 35<Ct 值≤ 38,且曲線有明顯的增長(zhǎng)曲線,判定為陽(yáng)性,否則為陰性;

陰性:樣本檢測(cè)結(jié)果 Ct 值>38 或無(wú) Ct 值。

6.  質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)

陰性質(zhì)控品:Ct>38 或無(wú) Ct 值顯示;

陽(yáng)性質(zhì)控品:擴(kuò)增曲線有明顯指數(shù)生長(zhǎng)期,且 Ct 值≤32; 以上條件應(yīng)同時(shí)滿足,否則實(shí)驗(yàn)視為無(wú)效。

7.  檢測(cè)方法的局限性

? 樣本檢測(cè)結(jié)果與樣本收集、處理、運(yùn)送以及保存質(zhì)量有關(guān);

? 樣本提取過(guò)程中沒(méi)有控制好交叉污染,會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果;

? 陽(yáng)性對(duì)照、擴(kuò)增產(chǎn)物泄漏,會(huì)導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果;

? 病原體在流行過(guò)程中基因突變、重組,會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果;

? 不同的提取方法存在提取效率差異,會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果;

? 試劑運(yùn)輸,保存不當(dāng)或試劑配制不準(zhǔn)確引起的試劑檢測(cè)效能下降,出現(xiàn)假陰性或定量檢測(cè)不準(zhǔn)確的結(jié)果;

? 本檢測(cè)結(jié)果僅供參考,如須確診請(qǐng)結(jié)合臨床癥狀以及其他檢測(cè)手段。

【注意事項(xiàng)】

? 所有操作嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行;

? 試劑盒內(nèi)各種組分使用前應(yīng)自然融化,wan全混勻并短暫離心;

? 反應(yīng)液應(yīng)避光保存;

? 反應(yīng)中盡量避免氣泡存在,管蓋需蓋緊;

? 使用一次性吸頭、一次性手套和各區(qū)專用工作服;

? 樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區(qū)進(jìn)行,以免交叉污染;

? 實(shí)驗(yàn)完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺(tái)和移液器;

? 試劑盒里所有物品應(yīng)視為污染物對(duì)待,并按照《微生物生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室生物安全   通則》進(jìn)行處理。

【參考文獻(xiàn)】

[1] 陳愛(ài)平, 江育林, 錢冬, 等. 病毒性神經(jīng)壞死病[J]. 中國(guó)水產(chǎn), 2010.

[2] 中國(guó)農(nóng)業(yè)部. SC/T 7216-2012 魚(yú)類病毒性神經(jīng)壞死病(VNN)診斷技術(shù)規(guī)程[S]. [3]羅衛(wèi). 魚(yú)類病毒性神經(jīng)壞死病的病原學(xué)研究及檢測(cè)方法的建立[J]. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué), 2007.


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