轉(zhuǎn)基因植物CamV35S 啟動(dòng)子核酸檢測(cè)試劑盒(熒光-PCR 法)
【產(chǎn)品名稱(chēng)】
通用名稱(chēng):轉(zhuǎn)基因植物 CamV35S 啟動(dòng)子核酸檢測(cè)試劑盒(熒光-PCR 法) Name :CamV35S Gene Detection Kit (Real-Time PCR Method)
【包裝規(guī)格】50T/盒
【預(yù)期用途】
自世界上di一例轉(zhuǎn)基因作物問(wèn)世以來(lái),轉(zhuǎn)基因作物迅猛發(fā)展。轉(zhuǎn)基因作物在抗蟲(chóng)、抗病、抗逆、高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)等方面取得了一定成就,特別是與人密切相關(guān)的轉(zhuǎn)基因食品。為保護(hù)貿(mào)易、明確消費(fèi),各國(guó)政府均對(duì)安全監(jiān)管提出了更高的要求?;ㄒ嘶ㄈ~病毒 35S 啟動(dòng)子(CamV35S)是轉(zhuǎn)基因作物中最經(jīng)常用到的 2 個(gè)元件之一, 到目前為止,62%授權(quán)商業(yè)化種植的轉(zhuǎn)基因作物中含有 CamV35S。熒光 PCR 技術(shù)因其靈敏度高、特異性強(qiáng)等特點(diǎn),在轉(zhuǎn)基因檢測(cè)中發(fā)揮了重要作用。
本試劑盒適用于檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植物的 CamV35S 基因,用于篩查待檢測(cè)植物中是否含有 CamV35S 成分。
【檢驗(yàn)原理】
本試劑盒根據(jù) CamV35S 啟動(dòng)子序列設(shè)計(jì)特異性引物和探針[1-2],用熒光 PCR 技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)基因成分的檢測(cè)。
【試劑組成】
名 稱(chēng) | 規(guī) 格 |
酶液 | 50μL×1 管 |
CamV35S 反應(yīng)液 | 500μL×2 管 |
CamV35S 陽(yáng)性質(zhì)控品 | 50μL ×1 管 |
陰性質(zhì)控品 | 250μL ×1 管 |
注:
1) 不同批號(hào)試劑不能混用。
2) 試劑盒內(nèi)各試劑組份足夠包裝規(guī)格所標(biāo)示的檢測(cè)次數(shù)。
【儲(chǔ)存條件及有效期】
-20℃避光保存、運(yùn)輸、反復(fù)凍融不超過(guò) 5 次,有效期 12 個(gè)月。
【適用儀器】
ABI 、安捷倫 MX3000P/3005P、MJ Opticon2、LightCycler480、Bio-Rad、eppendorf 等系列熒光定量 PCR 檢測(cè)儀。
【標(biāo)本采集】
稱(chēng)取 200g 樣品。
【保存和運(yùn)輸】
上述標(biāo)本短期內(nèi)可保存于-20℃,長(zhǎng)期保存可置-70℃,但不能超過(guò) 6 個(gè)月,標(biāo)本運(yùn)送應(yīng)采用 0℃冰壺。
【使用方法】
1. 樣品處理(樣本處理區(qū))
1.1 樣本前處理
固體樣本:用粉碎機(jī)或冷凍研磨儀將樣品研磨至細(xì)粉狀。
1.2 DNA 提取
推薦采用優(yōu)利科(上海)生命科學(xué)有限公司生產(chǎn)的 DNA 提取試劑盒(離心柱提取
法),請(qǐng)按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。
2. 試劑配制(試劑準(zhǔn)備區(qū))
根據(jù)待檢測(cè)樣本總數(shù),設(shè)所需要的 PCR 反應(yīng)管管數(shù)為 N(N=樣本數(shù)+1 管陰性對(duì)照+1 管陽(yáng)性對(duì)照;反應(yīng)管數(shù)每滿 10 份,多配制 1 份),每測(cè)試反應(yīng)體系配制如下表:
試劑 | CamV35S 反應(yīng)液 | 酶液 |
用量 | 20μL | 1μL |
將混合好的測(cè)試反應(yīng)液分裝到 PCR 反應(yīng)管中,21uL/管。
3. 加樣(樣本處理區(qū))
將步驟 1 提取的 DNA、陽(yáng)性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品各取 4μL,加入相應(yīng)的反應(yīng)管中,蓋好管蓋,混勻,短暫離心。
4. PCR 擴(kuò)增(核酸擴(kuò)增區(qū))
4.1 將待檢測(cè)反應(yīng)管置于熒光定量 PCR 儀反應(yīng)槽內(nèi);
4.2 設(shè)置好通道、樣品信息,反應(yīng)體系設(shè)置為 25ul;熒光通道選擇: 檢測(cè)通道
(Reporter Dye)FAM, 淬滅通道(Quencher Dye)選擇 NONE,ABI 系列儀器請(qǐng)勿選擇 ROX 參比熒光,選擇 None 即可。
4.3 推薦循環(huán)參數(shù)設(shè)置:
步驟 | 循環(huán)數(shù) | 溫度 | 時(shí)間 | 收集熒光信號(hào) |
1 | 1 cycle | 95℃ | 10min | 否 |
2 | 40 cycles | 94℃ | 15sec | 否 |
55℃ | 30sec | 是 |
5. 結(jié)果分析判定
5.1 結(jié)果分析條件設(shè)定
設(shè)置 Baseline 和 Threshold:一般直接按機(jī)器自動(dòng)分析的結(jié)果分析,當(dāng)曲線出現(xiàn)整體傾斜時(shí),根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié) Baseline 的 start 值(一般可在 3~15 范圍內(nèi)調(diào)節(jié))、stop 值(一般可在 5~20 范圍內(nèi)調(diào)節(jié)),以及Threshold 的 Value 值(上下拖動(dòng)閾值線至高于陰性對(duì)照),重新分析結(jié)果。
5.2 結(jié)果判斷
陽(yáng)性:檢測(cè)通道 Ct 值≤35,且曲線有明顯的指數(shù)增長(zhǎng)曲線;
可疑:檢測(cè)通道 35<Ct 值≤38,建議重復(fù)檢測(cè),如果檢測(cè)通道仍為 35<Ct 值≤ 38,且曲線有明顯的增長(zhǎng)曲線,判定為陽(yáng)性,否則為陰性;
陰性:樣本檢測(cè)結(jié)果 Ct 值>38 或無(wú) Ct 值。
6. 質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)
陰性質(zhì)控品:Ct>38 或無(wú) Ct 值顯示;
陽(yáng)性質(zhì)控品:擴(kuò)增曲線有明顯指數(shù)生長(zhǎng)期,且 Ct 值≤32; 以上條件應(yīng)同時(shí)滿足,否則實(shí)驗(yàn)視為無(wú)效。
7. 檢測(cè)方法的局限性
? 樣本檢測(cè)結(jié)果與樣本收集、處理、運(yùn)送以及保存質(zhì)量有關(guān);
? 樣本提取過(guò)程中沒(méi)有控制好交叉污染,會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果;
? 陽(yáng)性對(duì)照、擴(kuò)增產(chǎn)物泄漏,會(huì)導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果;
? 病原體在流行過(guò)程中基因突變、重組,會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果;
? 不同的提取方法存在提取效率差異,會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果;
? 試劑運(yùn)輸,保存不當(dāng)或試劑配制不準(zhǔn)確引起的試劑檢測(cè)效能下降,出現(xiàn)假陰性或 定量檢測(cè)不準(zhǔn)確的結(jié)果;
? 本檢測(cè)結(jié)果僅供參考,如須確診請(qǐng)結(jié)合臨床癥狀以及其他檢測(cè)手段。
【注意事項(xiàng)】
? 所有操作嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行;
? 試劑盒內(nèi)各種組分使用前應(yīng)自然融化,wan全混勻并短暫離心;
? 反應(yīng)液應(yīng)避光保存;
? 反應(yīng)中盡量避免氣泡存在,管蓋需蓋緊;
? 使用一次性吸頭、一次性手套和各區(qū)專(zhuān)用工作服;
? 樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區(qū)進(jìn)行,以免交叉污染;
? 實(shí)驗(yàn)完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺(tái)和移液器;
? 試劑盒里所有物品應(yīng)視為污染物對(duì)待,并按照《微生物生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室生物安全 通則》進(jìn)行處理。.
【參考文獻(xiàn)】
[1] 中國(guó)農(nóng)業(yè)部. 1782 號(hào)公告-3-2012 轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品成分檢測(cè)調(diào)控元件CamV 35S 啟動(dòng)子、FMV 35S 啟動(dòng)子、NOS 啟動(dòng)子、NOS 終止子和 CaMV 35S 終止子定性 PCR 方法[S]. 北京: 科學(xué)出版社, 2012.
[2] 徐俊鋒, 王鵬飛, 李玥瑩, 等. 轉(zhuǎn)基因植物中CaMV35S 和tNOS 元件的 4 種定性PCR 檢測(cè)方法的比較. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào), 2015 , 23 (3) :397-407.
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