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轉(zhuǎn)基因植物NOS 終止子核酸檢測試劑盒說明書

發(fā)布時間:2023/3/14      點擊次數(shù):974

轉(zhuǎn)基因植物NOS 終止子核酸檢測試劑盒(熒光-PCR 法)


【產(chǎn)品名稱】

通用名稱:轉(zhuǎn)基因植物 NOS 終止子核酸檢測試劑盒(熒光-PCR 法) 

Name :tNOS Gene Detection Kit (Real-Time PCR Method)

【包裝規(guī)格】50T/盒

【預(yù)期用途】

根農(nóng)桿菌煙脂堿合成酶基因終止子(tNOS)是轉(zhuǎn)基因作物常用到的元件之一,   到目前為止,43%的轉(zhuǎn)基因作物含有 NOS 終止子。熒光 PCR 技術(shù)因其靈敏度高、特異性強等特點,在轉(zhuǎn)基因檢測中發(fā)揮了重要作用。

本試劑盒適用于檢測轉(zhuǎn)基因植物的 NOS 終止子基因,用于篩查待檢測植物中是否含有 NOS 成分。。

【檢驗原理】

本試劑盒根據(jù) NOS 終止子序列設(shè)計特異性引物和探針[1-3],用熒光 PCR 技術(shù)進行轉(zhuǎn)基因成分的檢測。

【試劑組成】

名          稱

規(guī)         格

酶液

50μL×1 管

tNOS 反應(yīng)液

500μL×2 管

tNOS 陽性質(zhì)控品

50μL ×1 管

陰性質(zhì)控品

250μL ×1 管







注:

1)  不同批號試劑不能混用。

2)  試劑盒內(nèi)各試劑組份足夠包裝規(guī)格所標(biāo)示的檢測次數(shù)。

【儲存條件及有效期】

-20℃避光保存、運輸、反復(fù)凍融不超過 5 次,有效期 12 個月。

【適用儀器】

ABI 、安捷倫 MX3000P/3005P、MJ Opticon2、LightCycler480、Bio-Rad、eppendorf 等系列熒光定量 PCR 檢測儀。

【標(biāo)本采集】

稱取 200g 樣品。

【保存和運輸】

上述標(biāo)本短期內(nèi)可保存于-20℃,長期保存可置-70℃,但不能超過 6 個月,標(biāo)本運送應(yīng)采用 0℃冰壺。

【使用方法】

1.  樣品處理(樣本處理區(qū))

1.1  樣本前處理

固體樣本:用粉碎機或冷凍研磨儀將樣品研磨至細(xì)粉狀。

1.2  DNA 提取

推薦采用優(yōu)利科(上海)生命科學(xué)有限公司生產(chǎn)的 DNA 提取試劑盒(離心柱提取

法),請按照試劑盒說明書進行操作。

2.  試劑配制(試劑準(zhǔn)備區(qū))

根據(jù)待檢測樣本總數(shù),設(shè)所需要的 PCR 反應(yīng)管管數(shù)為 N(N=樣本數(shù)+1 管陰性對照+1 管陽性對照;反應(yīng)管數(shù)每滿 10 份,多配制 1 份),每測試反應(yīng)體系配制如下表:

試劑

tNOS   反應(yīng)液

酶液

用量

20μL

1μL

將混合好的測試反應(yīng)液分裝到 PCR 反應(yīng)管中,21uL/管。

3.  加樣(樣本處理區(qū))

將步驟 1 提取的 DNA、陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品各取 4μL,加入相應(yīng)的反應(yīng)管中,蓋好管蓋,混勻,短暫離心。

4.  PCR 擴增(核酸擴增區(qū))

4.1 將待檢測反應(yīng)管置于熒光定量 PCR 儀反應(yīng)槽內(nèi);

4.2 設(shè)置好通道、樣品信息,反應(yīng)體系設(shè)置為 25ul;熒光通道選擇: 檢測通道

(Reporter Dye)FAM, 淬滅通道(Quencher Dye)選擇 NONE,ABI 系列儀器請勿選擇 ROX 參比熒光,選擇 None 即可。

4.3 推薦循環(huán)參數(shù)設(shè)置:


步驟

循環(huán)數(shù)

溫度

時間

收集熒光信號

1

1 cycle

95℃

10min

2

40 cycles

94℃

15sec

55℃

30sec






5.  結(jié)果分析判定

5.1  結(jié)果分析條件設(shè)定

設(shè)置 Baseline 和 Threshold:一般直接按機器自動分析的結(jié)果分析,當(dāng)曲線出現(xiàn)整體傾斜時,根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié) Baseline 的 start 值(一般可在 3~15 范圍內(nèi)調(diào)節(jié))、stop 值(一般可在 5~20 范圍內(nèi)調(diào)節(jié)),以及Threshold 的 Value 值(上下拖動閾值線至高于陰性對照),重新分析結(jié)果。

5.2  結(jié)果判斷

陽性:檢測通道 Ct 值≤35,且曲線有明顯的指數(shù)增長曲線;

可疑:檢測通道 35<Ct 值≤38,建議重復(fù)檢測,如果檢測通道仍為 35<Ct 值

≤38,且曲線有明顯的增長曲線,判定為陽性,否則為陰性; 陰性:樣本檢測結(jié)果 Ct 值>38 或無 Ct 值。

6.  質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)

陰性質(zhì)控品:Ct>38 或無 Ct 值顯示;

陽性質(zhì)控品:擴增曲線有明顯指數(shù)生長期,且 Ct 值≤32; 以上條件應(yīng)同時滿足,否則實驗視為無效。

7.  檢測方法的局限性

? 樣本檢測結(jié)果與樣本收集、處理、運送以及保存質(zhì)量有關(guān);

? 樣本提取過程中沒有控制好交叉污染,會出現(xiàn)假陽性結(jié)果;

? 陽性對照、擴增產(chǎn)物泄漏,會導(dǎo)致假陽性結(jié)果;

? 病原體在流行過程中基因突變、重組,會導(dǎo)致假陰性結(jié)果;

? 不同的提取方法存在提取效率差異,會導(dǎo)致假陰性結(jié)果;

? 試劑運輸,保存不當(dāng)或試劑配制不準(zhǔn)確引起的試劑檢測效能下降,出現(xiàn)假陰性或   定量檢測不準(zhǔn)確的結(jié)果;

? 本檢測結(jié)果僅供參考,如須確診請結(jié)合臨床癥狀以及其他檢測手段。

 

【注意事項】

? 所有操作嚴(yán)格按照說明書進行;

? 試劑盒內(nèi)各種組分使用前應(yīng)自然融化,wan全混勻并短暫離心;

? 反應(yīng)液應(yīng)避光保存;

? 反應(yīng)中盡量避免氣泡存在,管蓋需蓋緊;

? 使用一次性吸頭、一次性手套和各區(qū)專用工作服;

? 樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區(qū)進行,以免交叉污染;

? 實驗完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺和移液器;

? 試劑盒里所有物品應(yīng)視為污染物對待,并按照《微生物生物醫(yī)學(xué)實驗室生物安全   通則》進行處理。.

【參考文獻】

[1]  中國農(nóng)業(yè)部. 1782 號公告-3-2012 轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品成分檢測調(diào)控元件CamV 35S 啟動子、FMV 35S 啟動子、NOS 啟動子、NOS 終止子和 CaMV 35S 終止子定性 PCR 方法[S]. 北京: 科學(xué)出版社, 2012.

[2] 徐俊鋒, 王鵬飛, 李玥瑩, 等. 轉(zhuǎn)基因植物中CaMV35S 和tNOS 元件的 4 種定性PCR 檢測方法的比較. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報, 2015 , 23 (3) :397-407.

[3] 周建嫦, 楊明杰, 楊杏芬. PCR 法檢測食品和動物飼料中的轉(zhuǎn)基因成分[J]. 衛(wèi)生研究, 2005 , 34 (6) :732-735.


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