乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶(ChAT)測試盒說明書
一、測定原理:
乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶(choline acetyltransferase ChAT)的測定是以乙酰輔酶 A 和膽堿為底物,在 ChAT 的作用下,反應(yīng)的生成物和顯色劑結(jié)合,在 324nm 處測定吸光度,以此計算 ChAT 的活力。
試劑一:液體 6mL×1 瓶,4℃保存。室溫低時會有結(jié)晶析出,測試前 37℃水浴至澄清。
試劑二:粉劑×1 支,臨用前加 220μL 的蒸餾水,充分溶解;用不完的試劑-20℃以下保存。
試劑三:粉劑×1 支,臨用時每支加雙蒸水 440μL,用不完的試劑-20℃以下保存。
試劑四:液體×1 支,臨用前每支用雙蒸水 1:1 稀釋,4℃保存。
試劑五:液體×1 支,4℃保存。
試劑六:液體×1 支,4℃保存。試劑七:液體×1 支,4℃保存。
1、樣本前處理:
10%勻漿液的制備:準確稱取組織重量,按重量(g):體積(mL)=1:9 的比例,加入 9 倍體積的生理鹽水,2500 轉(zhuǎn)/分,離心 10 分鐘,取上清液,再用生理鹽水 2 倍稀釋后測定;
測定管 | 對照管 | |
試劑一(μL) | 105 | 105 |
試劑二(μL) | 5 | 5 |
試劑三(μL) | 10 | 10 |
試劑四(μL) | 10 | 10 |
試劑五(μL) | 10 | 10 |
試劑六 (μL) | 10 | 10 |
混勻,37°C 水浴預(yù)溫 5 分鐘 | ||
5%的組織勻漿上清(μL) | 25 | (煮沸的勻漿上清)25 |
混勻,37°C 水浴 20 分鐘,100°C 沸水水浴 2 分鐘終止反應(yīng) | ||
蒸餾水 (μL) | 425 | 425 |
混勻,4000 r/min×10min 離心后取上清進行顯色反應(yīng) | ||
上清 (μL) | 500 | 500 |
試劑七(μL) | 10 | 10 |
混勻,靜置 15 分鐘,在 324nm 處,用 1cm 光徑,2mm 內(nèi)徑的石英比色皿,蒸餾 水調(diào)零,測定各管的吸光度值。 |
乙酰膽堿 Ach 是調(diào)節(jié)食道平滑肌運動的主要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)。食道平滑肌收縮主要是由于 Ach 釋放引起。而乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶(Choline acetyltransferase ChAT)和乙酰膽堿脂酶(Acetylcholinesterase ACHE)分別是
Ach 的合成酶和水解酶,調(diào)節(jié) Ach 的代謝。食道組織中這兩個酶的活力代表了食管內(nèi)源性膽堿能神經(jīng)功能狀態(tài)。
乙酰膽堿是延髓脊髓運動神經(jīng)元,自主神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)節(jié)前纖維,神經(jīng)節(jié)后膽堿能(副交感神經(jīng))纖維,以 及中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)許多神經(jīng)元(例如基底節(jié),大腦運動區(qū)皮層)的主要神經(jīng)遞質(zhì)。它是通過膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶的 作用,由膽堿與來自線粒體的乙酰輔酶 A 所合成。在獲得釋放后,乙酰膽堿刺激特殊的膽堿能受體,這種相互作用很快被局部的膽堿酯酶所終止,后者使乙酰膽堿被水解為膽堿與乙酸鹽。乙酰膽堿的水平由膽堿乙 酰轉(zhuǎn)移酶和膽堿的攝取所調(diào)控。
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